KHÁNG FSH
Dung hợp là quỏ trỡnh quan trọng trong sản xuất khỏng thể đơn dũng. Để quỏ trỡnh dung hợp tạo tế bào lai diễn ra thuận lợi và đạt kết quả cao cần cú 2 loại tế bào chủ yếu là tế bào Myeloma và lympho B. Ngoài ra cần bổ sung cỏc yếu tụ thỳc đẩy quỏ trỡnh dung hợp như: tế bào đại thực bào, FBS, polyethylenglycol (PEG).
• Tế bào đại thực bào (macrophage hay cũn gọi là feeder cell)
Cỏc tế bào đại thực bào cú mặt chủ yếu ở cỏc xoang cơ thể, đặc biệt là xoang bụng vỡ thế ta cú thể dễ dàng lấy tế bào đại thực bào từ ổ bụng.
toàn. Do đú chỳng khụng cú khả năng sinh sản liờn tục khi nuụi cấy in vitro. Cỏc kết quả nghiờn cứu trước đõy của nhúm nghiờn cứu cho thấy tế bào đại thực bào được chuẩn bị 3 ngày trước dung hợp sẽ giỳp quỏ trỡnh dung hợp đạt hiệu quả cao nhất .
Theo kết quả của chỳng tụi thỡ một con chuột cú thể cung cấp một lượng đại thực bào đủ cho 200 – 500 giếng nuụi tương ứng với mật độ 103 tế bào/ml.
Hỡnh 4.1. Tế bào feeder, độ phúng đại 10ì20
• Tế bào Myeloma
Tế bào Myeloma (Sp2/0, P3X) là tế bào ung thư tuỷ của chuột dũng BALB/c. Ở điều kiện nuụi cấy in vitro thớch hợp, tế bào sinh sản và phỏt triển rất nhanh, cú thể đạt nồng độ gấp 5 lần chỉ trong khoảng thời gian 30 giờ.
Vỡ vậy, chỳng đũi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn lấy từ mụi trường. Để cú được tế bào Myeloma khoẻ mạnh và sẵn sàng cho việc dung hợp tế bào, chỳng tụi thấy mụi trường cú bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) là phự hợp. Và mụi trường nuụi cấy cần được tiến hành thay thường xuyờn 3 ngày một lần là điều kiện thớch hợp cho tế bào phỏt triển.
Hỡnh 4.2. Tế bào Sp2/0, độ phúng đại 10ì20
• Tế bào Lympho B mẫn cảm khỏng nguyờn FSH
Là những tế bào Lympho B đó mẫn cảm, thu từ lỏch chuột số 3.1 và 3.2 khi chuột được gõy miễn dịch bằng khỏng nguyờn FSH với liều 0,2 àg FSH/con/lần. Tế bào lympho B sau khi thu được của mỗi chuột đem chia làm 2 phần: 1 phần đem lai với tế bào Sp2/0, 1 phần đem lai với tế bào P3X. Chỳng tụi sử dụng 3 đĩa 96 giếng để lai tế bào lympho B với mỗi loại tế bào Myeloma nờn sẽ cú tổng là 6 đĩa.
• Kết quả dung hợp tạo tế bào lai:
Dung hợp tế bào lai được thực hiện theo quy trỡnh như đó trỡnh bày ở phần phương phỏp. Tế bào sau dung hợp được nuụi trờn 6 đĩa nhựa 96 giếng của Corning (tổng số là 576 giếng).
Sau 5 – 7 ngày dung hợp, chỳng tụi tiến hành sàng lọc tế bào bằng mụi trường chọn lọc HAT và HT để thu được tế bào lai (Hybridoma). Vỡ tế bào Myeloma khụng cú enzyme HPRT ( Hypoxanthin - phospho – ribosyl – transferase) dẫn đến khụng tổng hợp được ADN. Vỡ vậy, khi mụi trường cú HAT và HT, tế bào myeloma sẽ khụng tổng hợp được AND do bazơ cung cấp cho quỏ trỡnh tổng hợp ADN ở dạng liờn kết nờn đũi hỏi phải cú enzym để
thuỷ phõn liờn kết này. Như thế, tế bào Myeloma sẽ chết sau vài ngày. Tế bào Lympho B phỏt triển bỡnh thường trong mụi trường HAT do nú cú enzyme HPRT nhưng tế bào Lympho B cũng chết sau 1 – 2 ngày vỡ khụng tiếp tục sinh sản. Do đú, chỉ cỏc tế bào lai tồn tại được trong mụi trường HAT và HT nhờ cú ưu thế lai.
Hỡnh 4.3. Tế bào Lympho B và tế bào Sp2/0 dung hợp và phỏt triển trờn nền tế bào feeder, độ phúng đại
10ì20
Sau 15 ngày nuụi cấy sau khi dung hợp và đó chọn lọc bằng mụi trường HAT và HT, chỳng tụi tiến hành kiểm tra toàn bộ số giếng dưới kớnh hiển vi soi ngược với độ phúng đại 10 x 20 và đỏnh dấu những giếng cú tế bào lai. Tiếp theo, cỏc giếng cú tế bào lai được thu nhận dịch nổi để kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng FSH bằng phương phỏp ELISA giỏn tiếp. Kết quả thu được về tỷ lệ giếng cú tế bào lai dương tớnh trờn tổng số giếng thực hiện dung hợp giữa tế bào lympho B của chuột với 2 dũng tế bào Sp2/0 và P3X- Ag18 được trỡnh bày túm tắt ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng khỏng FSH trờn 2 dũng tế bào myeloma Chuột TNo Cỏc chỉ số TNo Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 Tổng số P3X Sp 2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 Số giếng thực hiện dung hợp tế bào 144 144 144 144 288 288
Số giếng cú tế bào lai 99 101 102 110 201 211
Tỷ lệ % giếng cú tế bào lai 68,75% 70,14 % 70,83% 76,39% 69,79% 73,26% Số giếng cú khỏng thể 55 67 69 78 124 145 Tỷ lệ % giếng cú tế
bào lai sinh khỏng thể 55,56% 66,34% 67,65% 70,91% 61,69% 68,72%
Kết quả bảng 4.2 cho thấy:
• Nhỡn chung số giếng cú tế bào lai bởi quỏ trỡnh dung hợp giữa tế bào Lympho B tỏch từ lỏch của chuột lai với dũng Sp2/0 là 211 giếng cao hơn khi lai với dũng P3X là 201 giếng.
• Tế bào lỏch của chuột số 3.1 và 3.2 khi lai với dũng SP2/0 cho hiệu quả lai bằng 73,26% trong khi đú dũng P3X hiệu quả lai chỉ cú 69,79%.
Như vậy việc sử dụng dũng tế bào Sp2/0 để dung hợp với tế bào lympho B tạo tế bào lai hiệu quả hơn so với sử dụng dũng tế bào P3X. Trong quỏ trỡnh nhõn nuụi tế bào, chỳng tụi nhận thấy rằng dũng Sp2/0 cú sức sống mạnh hơn dũng P3X trong điều kiện nuụi bỡnh thường với cả hai loại mụi trường DMEM và RPMI-1640, điều này cú thể giải thớch nguyờn nhõn dẫn đến sự khỏc biệt về kết quả lai với tế bào lỏch giữa hai dũng tế bào Sp2/0 và P3X.
ELISA ở bảng 4.2 cũng cho thấy:
• Số giếng cú tế bào lai sinh khỏng thể khỏng FSH khi lai với dũng Sp2/0 là 145 giếng/211 giếng cú tế bào lai cao hơn so với dũng P3X là 124 giếng/201 giếng cú tế bào lai.
• Giếng cú tế bào lai sinh khỏng thể khỏng FSH ở chuột số 3.2 (147 giếng) cho kết quả cao hơn chuột số 3.1 (122 giếng). Điều này cho thấy hiệu quả tạo tế bào lai cú sinh khỏng thể phụ thuộc nhiều vào sự đỏp ứng miễn dịch của chuột, chuột cú hiệu giỏ khỏng thể cao sẽ cho nhiều giếng cú khỏng thể hơn chuột cú hiệu giỏ khỏng thể thấp.
Do nhận thấy cỏc đặc tớnh tế bào lai của dũng Sp2/0 trội hơn so với dũng P3X kết hợp với kết quả kiểm tra bằng ELISA ở trờn chỳng tụi chọn ra giếng cú tế bào lai cú giỏ trị OD cao nhất của dũng Sp2/0 để tiến hành tỏch dũng nhằm tạo cỏc dũng sản xuất khỏng thể đơn dũng khỏng FSH mong muốn.