CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYấN FSH
Trong sản xuất khỏng thể đơn dũng, việc tỡm ra liều lượng khỏng nguyờn thớch hợp để gõy được đỏp ứng miễn dịch cho chuột là rất quan trong. Đõy là tiền đề cho việc thu nhận tế bào lympho B sản sinh khỏng thể mong muốn. Tế bào lympho B là yếu tố khụng thể thiếu để tạo dũng tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng sau này.
Trong thớ nghiệm của chỳng tụi, sỏu chuột cỏi BALB/c 6 tuần tuổi được chia làm ba lụ thớ nghiệm và gõy miễn dịch với cỏc liều khỏng nguyờn FSH khỏc nhau:
Lụ 1 gồm chuột số 1.1 và 1.2 sử dụng liều 0,05 àg/con/lần
Lụ 2 gồm chuột số 2.1 và 2.2 sử dụng liều 0,1 àg/con/lần
Lụ 3 gồm chuột số 3.1 và 3.2: 0,2 àg/con/lần
Sau thời gian gõy miễn dịch cho chuột theo quy trỡnh gõy miễn dịch đó được trỡnh bày ở phần phương phỏp, chỳng tụi tiến hành lấy mẫu mỏu của từng chuột thớ nghiệm và tỏch huyết thanh để đỏnh giỏ đỏp ứng miễn dịch thụng qua xỏc định nồng độ của khỏng thể trong huyết thanh bằng phương phỏp ELISA giỏn tiếp.
Để tiến hành phản ứng ELISA giỏn tiếp cần phải cú 4 yếu tố sau: khỏng nguyờn đó biết, khỏng thể 1 cần kiểm tra, khỏng thể 2 gắn enzym và cơ chất hiện mầu. Quan sỏt màu thay đổi khi đưa cơ chất vào mỗi giếng, cơ chất sẽ tạo màu dưới tỏc dụng của enzyme.
Trong cỏc thớ nghiệm được thực hiện, chỳng tụi sử dụng cơ chất là TMB, enzym gắn khỏng thể là peroxydase. Khi cơ chất và enzym gặp nhau
thỡ phản ứng sinh màu xanh da trời, màu vàng xuất hiện khi dừng phản ứng bằng H2SO4. Kết quả của phản ứng ELISA (giỏ trị OD) được đo ở bước súng 450 nm bằng mỏy Microplate Reader (BioRad) nhằm kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng đặc hiệu khỏng nguyờn FSH.
Kết quả phản ứng ELISA xỏc định tương đối hàm lượng khỏng thể khỏng FSH trong huyết thanh được trỡnh bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả gõy đỏp ứng miễn dịch cho chuột Chuột thớ nghiệ m Chuột số 1.1 Chuột số 1.2 Chuột số 2.1 Chuột số 2.2 Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 ĐC õm (BSA) Giỏ trị OD 2,255 1,905 1,785 1,653 2,345 2,578 0,602 2,194 1,986 1,848 1,549 2,517 2,603 0,548 2,248 2,139 1,705 1,498 2,502 2,591 0,573 2,232± 0,033 2,010± 0,118 1,779± 0,072 1,567± 0,079 2,455± 0,095 2,590± 0,013 0,574± 0,027
Ghi chỳ: BSA (bovine serum albumin)
Kết quả bảng 4.1 cho thấy:
Với liều 0,05 àg FSH/con/lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra của chuột số 1.1 là 2,232 ± 0,033, của chuột số 1.2 là 2,010 ± 0,118
Với liều 0,1 àg FSH/con/lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra của chuột số 2.1 là 1,779 ± 0,072, của chuột số 2.2 là 1,567 ± 0,079
Với liều 0,2 àg FSH/con/lần thỡ giỏ trị OD của mẫu huyết thanh được kiểm tra của chuột số 3.1 là 2,455 ± 0,095, của chuột số 3.2 là 2,590 ± 0,013
Giỏ trị OD phản ỏnh hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh của mỗi chuột. Mật độ quang học càng lớn – giỏ trị OD càng lớn (tức là màu xanh càng đậm) thỡ lượng khỏng thể được giữ lại càng nhiều, điều này chứng tỏ
hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh lớn. Ngược lại mật độ quang học càng nhỏ - giỏ trị OD nhỏ (tức là màu xanh nhạt hơn) thỡ lượng khỏng thể được giữ lại càng ớt như vậy hàm lượng khỏng thể trong huyết thanh càng ớt.
Nếu trong mẫu khụng cú khỏng thể cần xỏc định thỡ phản ứng màu khụng xảy ra tức là màu xanh khụng xuất hiện. Với giỏ trị OD ≤ 0,574 ± 0,027 được coi là khụng cú khỏng thể.
Kết quả kiểm tra 6 mẫu huyết thanh của 6 chuột đều cho giỏ trị OD cao, điều này chứng tỏ cả 6 chuột thớ nghiệm đều cho đỏp ứng miễn dịch tốt. Tuy nhiờn mẫu huyết thanh của chuột ở lụ số 2 gồm chuột 2.1 và 2.2 cho kết quả với giỏ trị OD thấp nhất (OD = 1,779 và OD =1,567 một cỏch tương ứng). Như vậy, hàm lượng khỏng thể khỏng FSH trong huyết thanh của chuột ở lụ số 2 là thấp nhất tương ứng với liều 0,1 àg/con/lần cho đỏp ứng miễn dịch thấp nhất.
Mẫu huyết thanh của chuột ở lụ 3 gồm chuột số 3.1 và 3.2 cho kết quả với giỏ trị OD cao nhất (OD3.1 = 2,455 ±0,095, OD3.2 = 2,590 ±0,013) trong khi giỏ trị này ở chuột lụ 1 là OD1.1 = 2,232 ± 0,033, OD1.2 = 2,010 ± 0,118. Kết quả này cho thấy, hàm lượng thể khỏng FSH trong huyết thanh của chuột số 3.1 và 3.2 là cao nhất trong số 6 chuột tiến hành gõy miễn dịch. Điều đú cú nghĩa là khi gõy miễn dịch bằng cỏc liều lượng khỏng nguyờn khỏc nhau sẽ cho đỏp ứng miễn dịch khỏc nhau với khỏng nguyờn FSH và chỳng tụi nhận định rằng liều 0,2 àg FSH/con/lần là liều thớch hợp nhất để gõy miễn dịch cho chuột thớ nghiệm nhằm thu được những cỏ thể chuột cú đỏp ứng miễn dịch tốt nhất. * Căn cứ vào kết quả thu được ta thấy:
Khi gõy miễn dịch với liều lượng khỏng nguyờn khỏc nhau sẽ cho cỏc đỏp ứng miễn dịch khỏc nhau với cựng loại khỏng nguyờn FSH.
Với liều 0,2 àg FSH/con/lần cho kết quả đỏp ứng miễn dịch tốt nhất (giỏ trị OD của cỏc mẫu kiểm tra ở lụ 3 cao hơn giỏ trị OD của cỏc mẫu kiểm
tra ở lụ 1 và lụ 2).
Cựng lượng khỏng nguyờn 0,2 àg/con/lần nhưng chuột số 3.2 cho giỏ trị OD là 2,590 ± 0,013 cao hơn chuột số 3.1 cho giỏ trị OD là 2,455 ± 0,095.
Đỏp ứng miễn dịch cơ thể của từng cỏ thể sẽ phụ thuộc vào (i) Liều lượng khỏng nguyờn đưa vào cơ thể; (ii) Mỗi cỏ thể khỏc nhau sẽ cho đỏp ứng miễn dịch khỏc nhau với cựng loại và liều lượng khỏng nguyờn.
Dựa trờn kết quả đỏp ứng miễn dịch, chuột số 3.1 và 3.2 (lụ thớ nghiệm 3) cú đỏp ứng miễn dịch tốt hơn cả nờn sẽ được lựa chọn để lấy tế bào lympho B và dung hợp với tế bào myeloma nhằm thu được tế bào lai sinh khỏng thể đơn dũng cú chất lượng cao.
Đõy là bước lựa chọn cỏ thể chuột cú khả năng đỏp ứng miễn dịch tốt nhất, từ đú thu lấy tế bào lympho B của lỏch phục vụ cho bước dung hợp sau này. Đõy là bước khởi đầu của quỏ trỡnh nghiờn cứu và cũng quan trọng, vỡ nếu chỳng ta chọn được chớnh xỏc cỏ thể cú đỏp ứng miễn dịch tốt, sinh nhiều khỏng thể thỡ sẽ nõng cao chất lượng tế bào lympho B, từ đú tăng hiệu quả dung hợp tế bào.