3.1.5.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Để tìm đƣợc khoảng nồng độ của Vit.C tối ƣu xác định Vit.C bằng phƣơng pháp cực phổ tôi tiến hành khảo sát khoảng nồng độ mà chiều cao sóng cực phổ phụ thuộc tuyến tính vào nồng của Vit.C.
Chuẩn bị 3 dung dịch Vit.C có nồng độ chuẩn 1000 mg/L; 200 mg/L; 50mg/L. Hút 10 mL dung dịch đệm axetat 0,1M pH = 4,66 vào bình đo, đuổi khí oxi hòa tan trong 90s, thêm 3 lần, mỗi lần 0,1 mL dung dịch Vit.C chuẩn vào bình, đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm axetat. Lặp lại 2 lần với mỗi dung dịch Vit.C chuẩn thu đƣợc kết quả trong bảng sau: xi: nồng độ Vit.C (mg/L); yi: chiều cao sóng cực phổ của Vit.C (nA)
Bảng 3.5: Bảng số liệu xây dựng đƣờng chuẩn phụ thuộc chiều cao sóng cực phổ của Vit.C (yi, Na) vào nồng độ Vit.C (xi, mg/L)
STT xi y1i y2i yi xi2 xiyi ŷi (yi - ŷi)2 1 0,50 19,0 20,6 19,8 0,245 9,80 22,0 4,907 2 0,98 33,2 31,8 32,5 0,961 31,86 34,0 2,339 3 1,46 44,3 44,9 44,6 2,121 64,95 45,8 1,465 4 1,98 59,9 56,6 58,5 3,921 115,35 58,8 0,279 5 3,92 109 106 107,5 15,379 421,57 106,8 0,443 6 5,83 159 154 156,5 33,933 911,65 154,0 6,462 7 9,90 256 259 257,5 98,030 254,50 254,8 7,032 8 19,6 504 492 498,0 38,468 9764,71 495,1 8,237 9 29,1 731 724 727,5 848,336 21189,32 730,7 10,536
Xử lý số liệu theo phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu, lập chƣơng trình tính trên Excel, thu đƣợc kết quả:
Đƣờng chuẩn: y = (24,754 0,008)x + (9,8 2,5) Hay: ip =(24,754 0,008)CVit.C + (9,8 2,5)
Hình 3.7: Sóng cực phổ của Vit.C tại 9 mức nồng độ
Đƣờng chuẩn có độ tuyến tính tốt trong khoảng rộng từ 0,5 mg/L đến 30 mg/L (tƣơng đƣơng 2,8.10-6M đến 1,7.10-4
M) giúp cho việc pha mẫu thực tế đơn giản không quá phức tạp.
Thực nghiệm cho thấy khi đo đƣờng cực phổ của Vit.C tại nồng độ 40 mg/L (2,3.10-4M) thì píc xuất hiện vai. Khi nồng độ lớn đến một mức nào đó, chiều cao píc không còn phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của Vit.C, hơn nữa quá trình oxi hóa Vit.C trên điện cực không còn ổn định và không tuân theo quy luật.
3.1.5.2. Kiểm tra đƣờng chuẩn
Để kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn, pha dung dịch Vit.C có nồng độ coi nhƣ nồng độ thực (x), đo đƣờng cực phổ của Vit.C trong dung dịch đó, dùng đƣờng chuẩn xác định nồng độ Cx. So sánh Cx tìm đƣợc theo đƣờng chuẩn với giá trị thực x với độ tin cậy thống kê cho trƣớc để kết luận độ chính xác của đƣờng chuẩn tìm đƣợc.
Tiến hành đƣờng cực phổ Vit.C tại nồng độ x1 1,2mg/L và 8
, 4
2
x
đƣờng chuẩn ip =(24,754 0,007)CVit.C + (10 2), thu đƣợc giá trị nồng độ Cx1, Cx2 nhƣ trong bảng 3.6
Bảng 3.6: Đánh giá độ chính xác của đƣờng chuẩn ip = f(CVit.C)
Giá trị đo lặp lại Nồng độ Vit.C thực (mg/L)
1,20 4,80 1 2 3 4 5 6 7 8 1,180 1,176 1,216 1,167 1,224 1,188 1,180 1,200 4,846 4,815 4,735 4,735 4,815 4,775 4.856 4,735 Giá trị trung bình 1,191 4,790
Giới hạn tin cậy 0,017 0,044
Độ lệch chuẩn S 0,020 0,053
Độ lệch chuẩn giá trị
trung bình 0,007 0,019
Sai số tƣơng đối q% 1,05 0,84
Sai số tƣơng đối giữa lý thuyết và thực nghiệm % 0,73 0,21 Hằng số Student thực nghiệm 1,230 0,530 Hằng số Student lý thuyết 2,365 2,365
So sánh tTN với tb(0,05;7) = 2,365 thì tTN < tb. Vậy sự khác nhau giữa giá trị nồng độ C tính theo đƣờng chuẩn và giá trị xđã pha là do ngẫu nhiên với độ tin cậy là 95%. Xác định nồng độ trong khoảng 0,5 30 mg/L (2,84.10-6
1,70.10-4M) có độ đúng tốt. Phƣơng pháp đo không mắc sai số hệ thống Khi xác đinh mẫu thực tế, tiến hành đo khảo sát trƣớc, sau đó pha loãng dung dịch mẫu sao cho nồng độ nằm trong khoảng tối ƣu để xác định.
3.1.5.3. Giới hạn phát hiện của phƣơng pháp
Sử dụng đƣờng chuẩn, tính theo quy tắc 3
M L mg L mg a Cmin 3 0,2589 / 0,26 / 1,48.106
Thực nghiệm cho thấy trong điều kiện xác định đƣờng chuẩn, khi đo sóng cực phổ của Vit.C tại nồng độ 0,25 mg/L thì không xác định đƣợc píc của Vit.C. Kết quả này phù hợp với lý thuyết tính độ nhạy của phƣơng pháp là 0,26 mg/L.
Các kết quả về đƣờng chuẩn, giới hạn phát hiện đƣợc tính dựa trên kết quả ghi đƣờng cực phổ theo chƣơng đo của bảng 2.1. Vì vậy khi thay đổi chƣơng trình đo, gồm kích thƣớc giọt, biên độ xung, tốc độ quét… dẫn đến thay đổi giá trị chiều cao píc đo đƣợc, vì vậy hệ số a, b của đƣờng chuẩn cũng nhƣ giới hạn phát hiện có thể thay đổi. Tuy nhiên mục đích của bản khoá luận không phải tăng độ nhạy mà chỉ cần xác định khoảng nồng độ tối ƣu xác định Vit.C tại một điều kiện đo cố định đã chọn. Kết quả này định hƣớng cho các nghiên cứu trên mẫu thực tế tiếp theo.
3.1.6. Khảo sát các chất ảnh hƣởng
Nghiên cứu tài liệu cho thấy, trong các đối tƣợng thực tế nhƣ thuốc, các loại quả, các loại thực phẩm và một số loại nƣớc uống đóng hộp, một số chất thƣờng xuất hiện cùng với Vit.C. Đặc biệt là các Vitamin có nhóm B trong thuốc, hay các axit hữu cơ trong rau, quả, có hàm lƣợng tƣơng đối lớn, bằng hoặc nhiều hơn cả lƣợng Vit.C.
3.1.6.1. Khảo sát ảnh hƣởng của các axit hữu cơ
Axit oxalic, axit tactric, axit xitric, là 3 axit hữu cơ có nhiều nhất trong các loại rau quả. Công thức cấu tạo và pKa tƣơng ứng là
COOH C CH2COOH HOOCH2C OH C HO H CH OH
COOH HOOC COOH
Axit xitric Axit D- tactric Axit oxalic
HOOC
pKa1=3,128 pKa1=3,036 pKa1=1,27 pKa2=4,761 pKa2=4,366 pKa2=4,25 pKa3=6,396
Tiến hành thực nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của chúng lên píc của Vit.C. Đo đƣờng cực phổ của Vit.C 2mg/L khi có mặt các axit đó với tỷ lệ khối lƣợng gấp k lần. Kết quả đƣợc đƣa ra trong (bảng 3.7).
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của axit oxalic, axit xitric, axit tactric lên sóng cực phổ của Vit.C.
Axit Tactric Axit Xitric Axit Oxalic
Ca/C0 iP(nA) %iP/i0P Ca/C0 iP (nA) %ip/i0P Ca/C0 iP(nA) %iP/i0P
0 115 0,00 0 114 0,00 0 115 0,00 25 109 5,50 25 103 9,65 50 112 2,61 50 108 6,48 50 103 9,65 100 107 6,96 200 102 12,75 100 102 10,53 150 105 8,70 400 99,5 15,58 200 101 11,40 200 103 10,43 500 98 17,35 300 101 11,40 250 102 11,30 400 98,3 13,77 300 98,8 14,09 500 97,8 14,21
Nhận xét:
Kết quả cho thấy khi có mặt các axit hữu cơ khác gấp đến hàng trăm lần về khối lƣợng, píc của Vit.C ở nồng độ 2 mg/L vẫn cho kết quả tốt, píc vẫn cân đối, thế dịch chuyển ít về phía dƣơng hơn.
Chiều cao píc có bị giảm đi. Trƣờng hợp có mặt axit oxalic gấp 200 lần về khối lƣợng thì chiều cao píc mới giảm 10%, ở axit tactric là khoảng 150 lần còn axit xitric là 100 lần. píc của Vit.C bị giảm chỉ do khi hàm lƣợng các axit oxalic, axit xitric và axit tactric lớn, độ nhớt của dung dịch tăng và làm giảm hệ số khuếch tán. Phân tử của chúng càng cồng kềnh, độ linh động của dung dịch càng kém do đó nó ảnh hƣởng mạnh hơn đến chiều cao píc, có thể thấy axit xitric cồng kềnh hơn axit oxalic nên chỉ cần hàm lƣợng gấp 100 lần đã làm giảm píc đi 10% còn axit oxalic thì phải đến 200 lần.
Tuy nhiên việc giảm chiều cao píc không gây khó khăn cho phân tích nếu phân tích ở nồng độ 10-5M, mục đích là sóng cực phổ của Vit.C vẫn xuất hiện với chất lƣợng tốt. Hơn nữa ta thấy các axit này không chứa nhóm chức dễ bị oxi hóa nhƣ trong Vit.C. Do vậy chúng không thể hoạt tính cực phổ trong khoảng thế của Vit.C. Đây chính là một trong những ƣu điểm của phƣơng pháp phân tích cực phổ là có độ chọn lọc cao. Có thể phân tích một chất khi có mặt lƣợng lớn các chất khác.
Kết quả này cũng phù hợp với kết quả đƣa ra bởi phƣơng pháp phân tích Vit.C bằng điện cực biến tính và điện cực sinh học.
3.1.6.2. Khảo sát ảnh hƣởng của ion clorua
Trong các loại thực phẩm thƣờng chứa một lƣợng nhất định ion clorua. Ion này khi có mặt ở nồng độ lớn có thể gây cản trở quy trình phân tích. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát giới hạn nồng độ cho phép đối với ion clorua trong phƣơng pháp phân tích cực phổ Vit.C. Theo tài liệu nghiên cứu thì ion clorua ảnh hƣởng chủ yếu đến thế oxi hóa của giọt thủy ngân, nồng độ càng
lớn thì thế oxi hóa của thủy ngân càng chuyển về vùng âm hơn, nghĩa là chuyển dịch về phía píc của Vit.C. Đến một nồng độ nào đó, đƣờng cực phổ của thủy ngân sẽ bao trùm lên píc của Vit.C.
Tiến hành đo đƣờng cực phổ của Vit.C 2mg/L, thay đổi nồng độ ion clorua theo các hàm lƣợng: 5, 10, 50, 100, 250, 500 mg/L tƣơng ứng 1,4.10- 4
M; 2,8.10-4M; 1,4.10-3 M; 2,8.10-3M; 7.10-3M; 1,4.10-2M. Kết quả cho trong (hình 3.8).
Hình 3.8: Sóng cực phổ cuả Vit.C khi có mặt ion clorua với nồng độ tăng dần.
Nhân xét:
Khi hàm lƣợng ion clorua trong dung dịch tăng dần, giá trị thế đỉnh píc của Vit.C không thay đổi nhiều (từ -47,6mV khi không có Cl-
chuyển dịch theo chiều dƣơng đến -41,7mV khi nồng độ Cl-
lớn hơn 100mg/L), trong khi đó thế oxi hóa Hg chuyển dịch theo chiều âm, gần píc của Vit.C hơn. Do vậy khi nồng độ của nó lớn hơn 10-2M, mặc dù vẫn xuất hiện píc của Vit.C nhƣng máy tính không thể xác định chiều cao píc đƣợc nữa.
Có thể kết luận khi nồng độ ion clorua nhỏ hơn 10-2M thì vẫn có khả năng phân tích Vit.C bằng cực phổ. Thêm nữa hàm lƣợng của ion clorua trong
rau quả thực tế không vƣợt quá con số này. Trong trƣờng hợp hàm lƣợng ion clorua quá lớn, phải xử lý với bạc nitrat và lọc bỏ kết tủa.
3.1.7. Độ bền của Vit.C trong các môi trƣờng khác nhau
Vit.C là chất rất dễ bị phân hủy, nhất là trong dung dịch, nên luôn luôn phải pha mẫu chuẩn theo ngày. Tuy nhiên trong một ngày dung dịch Vit.C cũng có thể bị phân hủy một lƣợng nhỏ. Đặc biệt là khi xử lý mẫu rau, quả, quá trình xử lý mẫu buộc phải lọc ngoài không khí, thời gian lọc có lúc kéo dài 10 đến 15 phút, lƣợng oxi trong không khí nằm cân bằng với dung dịch và có thể làm giảm nồng độ của Vit.C. Để giảm tối đa hiệu ứng này, cần chọn dung dịch pha Vit.C, hay dung dịch dùng để chiết Vit.C trong mẫu thực tế sao cho độ bền của Vit.C trong đó là lớn nhất. Nghĩa là môi trƣờng đó phải hòa tan oxi kém hơn, kìm hãm tốc độ oxi hóa axit ascobic…
Theo tài liệu cho biết, Vit.C bền hơn trong môi trƣờng pH thấp. Đồng thời ở môi trƣờng axit oxi cũng hòa tan ít hơn. Có thể pha trong dung dịch đệm photphat, hoặc dung dịch hỗn hợp axit metaphotphat và axit axetic hay đơn giản là trong nƣớc. Tuy nhiên cơ chế phân hủy Vit.C bởi oxi rất phức tạp vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát độ bền của Vit.C trong các môi trƣờng khác nhau.
Do quy trình phân tích cực phổ Vit.C trong nền axetat nên chúng tôi chọn môi trƣờng là dung dịch axit axetic 0,1M (pH=2,76), dung dịch đệm axetat 0,1M (pH=4,66), và nƣớc. Tất cả dung dịch đều pha bằng nƣớc cất hai lần và đuổi oxi hòa tan trƣớc khi pha mẫu.
Pha loãng 5 lần dung dịch Vit.C gốc 1g/L bằng các dung dịch đã đƣợc đuổi oxi:
a, dung dịch axit axetic 0,1M; b, dung dịch đệm axetat 0,1M(5:5); c, nƣớc cất hai lần.
Để các dung dịch vừa pha tiếp xúc với không khí. Theo dõi nồng độ Vit.C trong các dung dịch này theo thời gian, sau t phút, lấy 0,1 mL từng dung dịch, đo sóng cực phổ của Vit.C trong 10mL dung dịch đệm axetat theo quy trình ghi trong bảng 2.1, ghi lại chiều cao píc sau mỗi lần đo. t=0, 30, 60, 180, 240 phút. Kết quả thu đƣợc trong (bảng 3.8).
Bảng 3.8: Chiều cao píc Vit.C theo thời gian trong các môi trƣờng khác nhau
Thời gian (phút) Vit.C 200 mg/L
Trong HAx Trong đệm Ax Trong nƣớc
0 69,5 66,9 69,7 30 70,8 67,1 68,6 60 70,7 64,7 68,9 180 70,9 57,8 69,2 240 69,7 54,0 68,0 Nhận xét:
Từ thực nghiệm cho thấy, sau 240 phút, Vit.C trong dung dịch axit axetic và trong nƣớc hầu nhƣ không thay đổi, mặc dù để ngoài không khí, còn trong dung dịch đệm axetat (5:5, pH=4,7) thì chiều cao píc giảm 5% sau 60 phút. Vì vậy pha dung dịch Vit.C gốc cũng nhƣ các dung dịch chuẩn pha loãng từ dung dịch gốc bằng nƣớc hoặc bằng dung dịch axit axetic đã loại oxi vẫn đảm bảo độ bền trong suốt thời gian làm việc. Tuy nhiên để đơn giản chúng tôi chọn dung môi nƣớc để pha chế dung dịch chuẩn.
Trong trƣờng hợp chiết Vit.C từ mẫu rau quả thực tế, kinh nghiệm cho thấy nếu chiết trong môi trƣờng pH thấp, thì có ƣu điểm là các chất màu, các chất hoạt động bề mặt sẽ bị kết tủa dạng keo, dung dịch chiết trong hơn, dễ lọc hơn. Vì vậy khi xử lý mẫu chúng tôi dùng dung dịch axit axetic 0,1M có
pH=2,76 để chiết Vit.C, đồng thời dịch chiết chứa Vit.C thu đƣợc sẽ bền trong quá trình đo.
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn độ bền của dung dịch Vit.C theo thời gian trong môi trƣờng khác nhau:
a. Vit.C pha trong axit axetic 0,1M b. Vit.C pha trong đệm axetat 0,1M c. Vit.C pha trong nƣớc.
Tóm tắt điều kiện tối ƣu xác định Vit.C
Qua khảo sát chúng tôi đã chọn đƣợc điều kiện tối ƣu xác định Vit.C bằng phƣơng pháp vôn- ampe.
Đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm axetat 0,1M có pH = 4,66 tƣơng ứng tỷ lệ CHAx = CAx, thời gian đuổi khí oxi hòa tan trƣớc khi cho Vit.C vào bình đo là 90s.
Khoảng nồng độ tối ƣu khi phân tích rộng, từ 0,5 đến 30 mg/L, tƣơng đƣơng 2,84.10-6
M 1,70.10-4M.
Chƣơng trình đo trên máy tính đƣợc chọn tối ƣu theo gợi ý của nhà sản xuất, theo tài liệu tham khảo, và theo kinh nghiệm thực tế.
- Thời gian cân bằng trƣớc khi quét thế: 10s, đủ để giúp cho dung dịch trở lại trạng thái tĩnh, ổn định sau khi khuấy trộn.
- Khoảng thế quét từ -250 mV đến +100 mV: khoảng thế này thu đƣợc từ kinh nghiệm thực tế, không nên quá hẹp vì sẽ không quét đƣợc hết chân phổ, tuy nhiên cũng không nên quá rộng sẽ tốn thời gian đo.
- Biên độ xung: 50 mV - Bƣớc nhảy thế: 6 mV
- Thời gian cho một xung: 40 ms - Thời gian một bƣớc nhảy thế: 0,4s - Tốc độ quét: 15 mV/s.
Dung dịch Vit.C gốc và các dung dịch chuẩn pha loãng từ dung dịch gốc phải đƣợc pha theo ngày và pha bằng nƣớc cất hai lần đã loại oxi hòa tan. Các dung dịch này đảm bảo độ bền trong thời gian phân tích.
Các axit hữu cơ nhƣ axit oxalic, axit xitric, axit tactric và ion clorua không ảnh hƣởng đến sóng cực phổ của Vit.C ở khoảng nồng độ cho phép.
3.2. XÁC ĐỊNH VIT.C TRONG MẪU THỰC TẾ 3.2.1. Mẫu nƣớc trái cây tƣơi 3.2.1. Mẫu nƣớc trái cây tƣơi
3.2.1.1. Nƣớc dứa ép
Dứa cắt nhỏ, ép lấy nƣớc, nồng độ Vit.C là Cm mg/L. Chuẩn bị hai mẫu Mẫu D1: 22,5 mL nƣớc ép + 2,5 mL nƣớc = 25 mL dung dịch mẫu D1, Cm1 = (22,5Cm)/25mg/L
Mẫu D2: 22,5 mL nƣớc ép + 2,5 mL dung dịch Vit.C 1g/L = 25 mL dung dịch mẫu D2, nồng độ Cm2 = (Cm1 + 100) mg/L
Xác định Vit.C trong hai mẫu theo phƣơng pháp thêm chuẩn:
Mẫu D1: thêm hai lần (x 0,1 mL) dung dịch Vit.C chuẩn 500mg/L vào (10 mL đệm + 0,2 mL mẫu), đo lặp 3 lần.
Mẫu C2: thêm 2 lần (x 0,1 mL) dung dịch Vit.C chuẩn 500 mg/L vào (10 mL đệm + 0,1 mL mẫu), đo lặp 3 lần.
Kết quả đo trong bảng 3.9 và hình 3.10.
Bảng 3.9: Số liệu xác định nồng độ Vit.C trong hai mẫu nƣớc dứa theo