2.2.2.1. Kĩ thuật xử lý mẫu thực tế
Mẫu nƣớc hoa quả tƣơi: Quả tƣơi rửa sạch, ép lấy nƣớc, pha loãng đến nồng độ thích hợp.
2.2.2.2. Phƣơng pháp xử lý kết quả
Mẫu thực tế sau khi đã xử lý đƣa về dạng dung dịch, đem đo sóng cực phổ. Để loại trừ ảnh hƣởng của nền, chúng tôi tiến hành xác định Vit.C trong các dung dịch mẫu theo phƣơng pháp thêm chuẩn.
V0: thể tích dung dịch đệm (mL) Vm: thể tích mẫu thêm vào (mL)
Vc: thể tích dung dịch Vit.C chuẩn (mL) Cc: nồng độ dung dịch Vit.C chuẩn (mg/L)
Cm : nồng độ Vit.C trong dung dịch mẫu cần xác định (mg/L)
Số lần thêm: n lần Số lần lặp: k lần.
Xây dựng đƣờng chuẩn y(aa)x(bb) theo phƣơng pháp hồi quy tuyến tính nhƣ mục 2.2.1.5, trong đó y là chiều cao píc của Vit.C (nA); x là nồng độ Vit.C thêm vào dung dịch (mg/L).
c m c c i iV V V V iC x 0 (2.16) i = 0 n
Đƣờng thêm chuẩn cắt trục hoành tại giá trị xm
Giá trị (xmx) đƣợc xác định vào định luật lan truyền sai số theo các công thức sau: b a b a x max b a b a x min (2.17) 2 min max x x xm 2 min max x x x
Nồng độ Vit.C trong mẫu đƣợc xác định theo công thức
m m m m V V V x C ( 0 ) m m x c V V V ) ( 0 (2.18)
Số liệu đo mẫu thực tế đƣợc xử lý trong chƣơng trình tính Excel theo các công thức trên.
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐIỀU KIỆN TỐI ƢU XÁC ĐỊNH VIT.C BẰNG PHƢƠNG PHÁP VÔN- AMPE VÔN- AMPE
3.1.1. Chọn nền
Việc phân tích hợp chất hữu cơ theo phƣơng pháp vôn- ampe (cực phổ) phụ thuộc rất nhiều vào tính chất của nền. Đặc biệt là cần nền ổn định,về độ dẫn điện, về lực ion và với việc phân tích hợp chất hữu cơ thì phải duy trì tốt pH. Vì vậy chúng tôi tiến hành thăm dò tính chất cực phổ của Vit.C 5 mg/L trong 3 nền khác nhau: nền đệm axetat, nền đệm photphat và nền đệm axit xitric- hidrophotphat. Mỗi nền đệm thử khảo sát tại các pH khác nhau.
Hút 10 mL dung dịch đệm vào bình đo, đuổi khí 300s, đo sóng cực phổ của nền, thêm 0,1 mL dung dịch Vit.C chuẩn 500 mg/L, đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm đã chọn. Kết quả đo đƣợc đƣa ra ở (hình 3.1) và (bảng 3.1)
Hình 3.1: Khảo sát tính chất cực phổ của Vit.C trong 3 nền: a: trong dung dịch đệm axetat
b: tron dung dịch đệm photphat
Bảng 3.1: Khảo sát sóng cực phổ của Vit.C trong các nền đệm khác nhau Đệm axetat pH 3,6 4,6 5,6 Ep (mV) 20,3 -33,3 -74,9 ip (nA) 222 196 189 Đệm photphat pH 5 6 7 8 Ep (mV) -73,9 -121 -169 -221 ip (nA) 228 204 194 166/95,9 Đệm axit xitric- hidrophotphat pH 3 5 7 Ep (mV) 36,9 -84,5 -168 ip (nA) 103 103 107 Nhận xét:
Khi phân tích hợp chất hữu cơ bằng phƣơng pháp cực phổ thƣờng dùng nền là các dung dịch đệm. Dung dịch đệm là hỗn hợp của một axit yếu và một bazo yếu, nó có khả năng duy trì môi trƣờng pH ổn định: thứ nhất là khi thêm vào hệ một lƣợng ít axit mạnh hay bazo mạnh thì pH của dung dịch thay đổi không đáng kể; thứ hai là khi pha loãng dung dịch đệm thì nồng độ dạng axit lẫn bazo đều giảm nhƣ nhau do đó pH cũng ít bị thay đổi.
Thực nghiệm khảo sát sóng cực phổ của Vit.C trong cả ba loại dung dịch đệm: axetat; photphat; axit xitric- hidrophotphat ở các pH khác nhau đều cho kết quả tƣơng đối tốt.
Trong nền đệm axetat, pH từ 3,6 đến 5,6 thế đỉnh píc của Vit.C nằm trong khoảng từ 50 mV. Píc nằm cách khá xa đƣờng oxi hóa của nền (tính từ thế đỉnh píc đến chân đƣờng oxi hóa của nền khoảng 150 mV). Chiều cao píc ổn định khi thay đổi pH của dung dịch đệm.
Trong nền đệm photphat, pH từ 5 đến 8 píc của Vit.C nằm trong khoảng -250 mV đến -50 mV, píc đẹp, cân đối, trừ trƣờng hợp pH = 8 xuất hiện hai píc của Vit.C . Vị trí píc chuyển dịch về thế âm hơn so với dùng đệm
axetat. Do đó chiều cao píc có thế bị ảnh hƣởng bởi píc của oxi hòa tan (ở - 100 mV) nếu oxi không bị loại trừ hoàn toàn.
Trong nền axit xitric- hidrophotphat (hình 3.1.c) thì chiều cao píc giảm đi rõ rệt, hơn thế nữa vị trí píc khá gần thế tại đó quá trình oxi hóa thủy ngân diễn ra.
Vì vậy, với mục đích chọn đƣợc nền thích hợp cho quá trình phân tích đƣờng cực phổ của Vit.C và thao tác pha chế đơn giản, chúng tôi chọn phân tích Vit.C trong nền axetat. Theo tài liệu tham khảo cũng cho biết Vit.C bền hơn trong môi trƣờng có pH nhỏ hơn 5, đệm pH của đệm axetat nằm trong khoảng 3,6 đến 5,6 thích hợp cho việc phân tích Vit.C bằng phƣơng pháp cực phổ.
3.1.2. Ảnh hƣởng của oxi hòa tan
Khi đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm axetat, nếu không đuổi khí oxi hòa tan thì sóng cực phổ rộng và tù (hình 3.2.a), khi đuổi oxi hoàn toàn tức là sau thời gian 300s, píc gọn và đẹp, chân píc hẹp, píc cân đối (hình 3.2.b). Chứng tỏ oxi hòa tan đã ảnh hƣởng đến píc của Vit.C và thời gian đuổi khí trƣớc khi quét thế là có liên quan đến chất lƣợng píc.
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của oxi hòa tan đến sóng cực phổ của Vit.C
a: Sóng cực phổ của Vit.C khi không đuổi khí oxi trong dung dịch b: Sóng cực phổ của Vit.C khi đuổi hoàn toàn khí oxi
Thực tế là nồng độ oxi hòa tan trong nƣớc khá lớn, khoảng 1,38.10-3 M ở 200
C. Quá trình khử oxi xảy ra theo hai bƣớc, bƣớc thứ nhất tạo ta hidro peoxit, bƣớc tiếp theo khử hidro peoxit thành nƣớc, theo hai bán phản ứng sau:
O2 + 2H+ +2e- → H2O2
H2O2 + 2H+ + 2e-→ 2H2O
Thế bán sóng của hai quá trình này tƣơng ứng là -0,1V và -0,9V (so với điện cực calomen bão hòa). Oxi hòa tan trong nƣớc ảnh hƣởng đến quá trình phân tích Vit.C, thứ nhất là chất lƣợng đƣờng cực phổ của Vit.C, thứ hai oxi hòa tan phản ứng với axit ascobic trong dung dịch, làm giảm đáng kể nồng độ trong quá trình phân tích.
Vì vậy trƣớc khi đo cần thiết phải đuổi oxi khỏi nền. Thời gian đuổi oxi cho phép đo cực phổ thƣờng là 4- 8 phút. Thực nghiệm cho thấy ở nồng độ chất phân tích chỉ 10-5 M thì không cần nhiều thời gian nhƣ vậy.
Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hƣởng của oxi hòa tan đến sóng cực phổ của Vit.C sau 0s, 30s, 60s, 90s, 120s, 150s, làm lặp lại 4 lần thu đƣợc kết quả trong (bảng 3.2).
Thời gian đƣợc chọn khi mà lƣợng oxi còn lại trong dung dịch không ảnh hƣởng đáng kể đến píc của Vit.C.
Bảng 3.2: Khảo sát sóng cực phổ của Vit.C theo thời gian đuổi oxi t(s) ip (nA) ip(nA) lần 1 lần 2 lần3 lần4 0 168 - - - 168 30 69.4 71.9 - - 70.7 60 52.6 53 53.8 55.3 53.7 90 50.2 49.5 49.5 52.6 50.5 120 49.4 48.2 49.6 50.9 49.5 150 49.8 - - 50.2 50.0 Nhận xét:
Sau 30s thì có xuất hiện píc của Vit.C nhƣng chân píc rộng, không cân đối, phải sau 90s, 120s, 150s chiều cao píc mới ổn định (bảng 3.2, hình 3.3). Có thể kết luận sau 90s, tại khoảng nồng độ Vit.C là 2 mg/L (khoảng 10-5M) thì oxi hòa tan không còn ảnh hƣởng đến sóng cực phổ của Vit.C nữa.
Vì vậy để rút ngắn thời gian phân tích, chúng tôi chọn đuổi khí trƣớc khi quét thế cho tất cả các phép đo tiếp theo là 90s.
Hình 3.3: Khảo sát ảnh hƣởng của oxi
3.1.3. pH của nền đệm axetat
pH của dung dịch nền ảnh hƣởng nhiều đến sóng cực phổ của hợp chất hữu cơ. Khi pH thay đổi, vị trí của píc chuyển dịch theo chiều dƣơng hoặc âm
tùy theo sự có mặt của ion H+ trong phƣơng trình cho nhận e- của hợp chất hữu cơ và tùy theo quá trình phân cực catot hay phân cực anot.
Phản ứng xảy ra trên điện cực của Vit.C là:
C6H8O6 C6H6O6 + 2H+ + 2e-
Để khảo sát ảnh hƣởng pH của dung dịch đệm lên sóng cực phổ của Vit.C chúng tôi tiến hành đo sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 2, 4, 6 mg/L trong các nền đệm axetat 0,1M có pH bằng 3,18; 4,01; 4,66; 5,26; 5,93 tƣơng ứng với tỷ lệ CHAx:CAx là 9,5:0,5; 8:2; 5:5; 2:8; 0,5:9,5.
Làm lặp lại 3 lần thu đƣợc kết quả trong bảng 3.3.
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 2, 4, 6 mg/L theo pH của đệm axetat
VHAc: VAc pH Ep (mV) CVit.C (mg/L) ip (nA) lần 1 lần 2 lần 3 9,5:0,5 3,18 23,8 2 63,9 62,6 63,2 4 119 62,6 117 6 169 116 167 8:2 4,01 -11,9 2 60,5 60,7 59,6 4 115 113 110 6 164 158 164 5:5 4,66 -41,7 2 55,7 55,4 54,6 4 105 103 101 6 152 152 146 2:8 5,26 -65,5 2 53,9 55,6 54,2 4 102 102 97,9 6 145 143 140 0,5:9,5 5,93 -89,3 2 53,2 54,2 53,1 4 97,7 99,1 97,5 6 141 139 137
Nhận xét:
Khi pH tăng, thế đỉnh píc của Vit.C chuyển dịch về phía âm hơn, tại pH = 3,18 Ep = +23,8 mV, khi tăng đến pH = 5,93 thì Ep = -89,3 mV. Sự chuyển dịch píc về vùng dƣơng trong môi trƣờng axit hơn do ion H+ có mặt trong bán phản ứng oxi hóa khử của Vit.C. Tốc độ quá trình oxi hóa Vit.C chậm hơn trong môi trƣờng axit, do đó Ep chuyển dịch về phía dƣơng hơn khi phân cực anot. Tuy nhiên chất lƣợng píc vẫn tốt, píc gọn và hẹp (hình 3.4). Chiều cao píc không thay đổi đáng kể, độ lặp tốt (bảng 3.3). Vị trí píc của Vit.C xác định đƣợc một cách dễ dàng.
Vì vậy để thuận tiện cho việc pha chế dung dịch đệm chúng tôi dùng đệm axetat có pH = 4,66 tƣơng ứng với tỷ lệ thể tích dung dịch HAc: Ac-
là 5:5, đồng thời khi CHAx =CAx thì dung dịch đệm có năng xuất tốt nhất.
Hình 3.4: Sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 2, 4, 6 mg/L trong đệm Axetat 0,1M; pH = 4,66
Hình 3.5: Sóng cực phổ xung vi phân của Vit.C trong đệm axetat 0,01 M
3.1.4. Nồng độ dung dịch đệm axetat
Để loại trừ ảnh hƣởng của dòng điện chuyển, nồng độ chất điện li nền thƣờng lớn hơn chất phân tích từ 25 đến 50 lần. Tức là ở nồng độ khoảng 10-5
M, thì nồng độ chất điện li 10-3M là đủ để triệt tiêu dòng điện chuyển.
Tuy nhiên thực nghiệm cho thấy, sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 5, 10, 15 mg/L tƣơng ứng với 2,8.10-5
M; 5,7.10-5M; 8,5.10-5M trong nền đệm axetat 0,01M, pH = 4,66 tƣơng ứng với nồng độ ion trơ (Na+
) trong dung dịch là 5.10-3M, gấp gần 60 lần chất phân tích thì đã cho kết quả không tốt. Sóng cực phổ không cân đối và không tuyến tính. (hình 3.5).
Để tìm đƣợc nồng độ đệm axetat tốt nhất cho phép đo xác định Vit.C, chúng tôi tiến hành khảo sát sóng cực phổ của Vit.C theo nồng độ dung dịch đệm axetat pH = 4,66. Chuẩn bị các dung dịch đệm axetat (5:5) có nồng độ tổng CHAc + CAx = 1M; 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,01M; 0,005M. Đo sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 5, 10, 15 mg/L. Kết quả đo cho trong (bảng 3.4).
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát sóng cực phổ của Vit.C tại 3 nồng độ 5, 10, 15 mg/L trong nền đệm axetat có nồng độ khác nhau.
CHAc+CAc (M) ip (nA) Phƣơng trình 2 r CVit.C (mg/L) 5 10 15 1 146 293 427 y = 29,2x+3 0,9996 0,5 163 320 461 y = 31,0x+12 0,9994 0,2 172 335 508 y = 35,0x-3,2 0,9995 0,1 185 370 541 y = 37,0x+3,4 0,9997 0,05 224 417 607 y = 39,8x+26,6 1,0000 0,01 322 532 689 y = 38,2x+141 0,9940 0,005 328 497 608 y = 29,1x+193 0,9872
Nhận xét:
Tại một nồng độ của Vit.C, nồng độ nền giảm thì chiều cao píc tăng lên, do sự tăng hệ số khuếch tán D khi độ nhớt của dung dịch giảm, tuy nhiên dung dịch đệm quá loãng thì píc bị nghiêng, không cân đối, (hình 3.5). Hơn nữa, khi thêm dần lƣợng Vit.C vào thì độ tăng chiều cao píc không còn tƣơng ứng với nồng độ thêm vào nữa, biểu hiện ở hệ số b trong phƣơng trình ở (bảng 3.4) càng khác không khi nồng độ nền càng giảm. Tại nồng độ 1M, giá trị b chỉ bằng 2% giá trị ip (tại nồng độ của Vit.C là 5 mg/L) thì khi nồng độ nền giảm xuống 5.10-3M giá trị b bằng 59%.
Ngƣợc lại, khi nồng độ nền cao, mặc dù sẽ trƣợt tiêu đƣợc tối đa dòng điện chuyển nhƣng điều đó cũng có nghĩa là các tạp chất do nền mang lại sẽ lớn. Đặc biệt là các ion kim loại, vì chỉ với hàm lƣợng rất nhỏ chúng cũng cho tín hiệu cực phổ.
Vì vậy, để tiết kiệm hóa chất nhƣng vẫn đảm bảo mục đích phân tích , chúng tôi chọn nồng độ nền axetat thích hợp là 0,1M. Khi đó nồng độ chất điện li trơ trong dung dịch là 5.10-2
M.
3.1.5. Khoảng nồng độ tối ƣu 3.1.5.1. Xây dựng đƣờng chuẩn 3.1.5.1. Xây dựng đƣờng chuẩn
Để tìm đƣợc khoảng nồng độ của Vit.C tối ƣu xác định Vit.C bằng phƣơng pháp cực phổ tôi tiến hành khảo sát khoảng nồng độ mà chiều cao sóng cực phổ phụ thuộc tuyến tính vào nồng của Vit.C.
Chuẩn bị 3 dung dịch Vit.C có nồng độ chuẩn 1000 mg/L; 200 mg/L; 50mg/L. Hút 10 mL dung dịch đệm axetat 0,1M pH = 4,66 vào bình đo, đuổi khí oxi hòa tan trong 90s, thêm 3 lần, mỗi lần 0,1 mL dung dịch Vit.C chuẩn vào bình, đo sóng cực phổ của Vit.C trong nền đệm axetat. Lặp lại 2 lần với mỗi dung dịch Vit.C chuẩn thu đƣợc kết quả trong bảng sau: xi: nồng độ Vit.C (mg/L); yi: chiều cao sóng cực phổ của Vit.C (nA)
Bảng 3.5: Bảng số liệu xây dựng đƣờng chuẩn phụ thuộc chiều cao sóng cực phổ của Vit.C (yi, Na) vào nồng độ Vit.C (xi, mg/L)
STT xi y1i y2i yi xi2 xiyi ŷi (yi - ŷi)2 1 0,50 19,0 20,6 19,8 0,245 9,80 22,0 4,907 2 0,98 33,2 31,8 32,5 0,961 31,86 34,0 2,339 3 1,46 44,3 44,9 44,6 2,121 64,95 45,8 1,465 4 1,98 59,9 56,6 58,5 3,921 115,35 58,8 0,279 5 3,92 109 106 107,5 15,379 421,57 106,8 0,443 6 5,83 159 154 156,5 33,933 911,65 154,0 6,462 7 9,90 256 259 257,5 98,030 254,50 254,8 7,032 8 19,6 504 492 498,0 38,468 9764,71 495,1 8,237 9 29,1 731 724 727,5 848,336 21189,32 730,7 10,536
Xử lý số liệu theo phƣơng pháp bình phƣơng tối thiểu, lập chƣơng trình tính trên Excel, thu đƣợc kết quả:
Đƣờng chuẩn: y = (24,754 0,008)x + (9,8 2,5) Hay: ip =(24,754 0,008)CVit.C + (9,8 2,5)
Hình 3.7: Sóng cực phổ của Vit.C tại 9 mức nồng độ
Đƣờng chuẩn có độ tuyến tính tốt trong khoảng rộng từ 0,5 mg/L đến 30 mg/L (tƣơng đƣơng 2,8.10-6M đến 1,7.10-4
M) giúp cho việc pha mẫu thực tế đơn giản không quá phức tạp.
Thực nghiệm cho thấy khi đo đƣờng cực phổ của Vit.C tại nồng độ 40 mg/L (2,3.10-4M) thì píc xuất hiện vai. Khi nồng độ lớn đến một mức nào đó, chiều cao píc không còn phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của Vit.C, hơn nữa quá trình oxi hóa Vit.C trên điện cực không còn ổn định và không tuân theo quy luật.
3.1.5.2. Kiểm tra đƣờng chuẩn
Để kiểm tra độ chính xác của đƣờng chuẩn, pha dung dịch Vit.C có nồng độ coi nhƣ nồng độ thực (x), đo đƣờng cực phổ của Vit.C trong dung dịch đó, dùng đƣờng chuẩn xác định nồng độ Cx. So sánh Cx tìm đƣợc theo đƣờng chuẩn với giá trị thực x với độ tin cậy thống kê cho trƣớc để kết luận độ chính xác của đƣờng chuẩn tìm đƣợc.
Tiến hành đƣờng cực phổ Vit.C tại nồng độ x1 1,2mg/L và 8
, 4
2
x
đƣờng chuẩn ip =(24,754 0,007)CVit.C + (10 2), thu đƣợc giá trị nồng độ Cx1, Cx2 nhƣ trong bảng 3.6
Bảng 3.6: Đánh giá độ chính xác của đƣờng chuẩn ip = f(CVit.C)