d) Đề nghị và điểm:
4.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho dược liệu nấm linh chi khô
4.4.1 Tiêu chuẩn đề nghị:
Căn cứ vào các nội dung đã trình bày ở trên, xin được đề nghị tiêu chuẩn kiểm nghiệm dược liệu nấm Linh chi khô như sau:
Linh chi (Quả thể) Ganoderma lucidum
Mô tả
Nấm Linh chi là dạng quả thể, mũ nấm hình thận, bán tròn hoặc hơi tròn, đường kính từ 10-18 cm, dày từ 1-2 cm. Vỏ cứng, có màu vàng nâu đến nâu đỏ, bóng, mép nấm tròn và có nếp nhăn, cạnh mỏng và hơi cong. Phần ruột nấm có màu trắng đến nâu. Cuống nấm hình trụ, dài từ 7-15 cm, đường kính từ 1-3,5 cm, có màu từ nâu đỏ đến tím nâu. Bào tử nhỏ và mịn, màu vàng nâu. Mùi thơm nhẹ, vị đắng.
Soi bột
Bột màu nâu nhạt, nậu đậm hoặc vàng nâu. Sợi nấm phân tán hoặc theo nhóm, không màu hoặc màu nâu nhạt, mỏng, hơi cong, phân nhánh. Đường kính từ 2,5-6,5 m. Bào tử màu nâu, hình trứng, có 2 lớp màng. Lớp ngoài trong suốt, không màu và mỏng; lớp trong màu vàng, có nhiều gai nhỏ dạng bứu dài từ 8-12 m, rộng 5-8 m.
Định tính:
A. Bằng các phương pháp hóa học (như phần 3.2.3). B. Thực hiện phương pháp sắc ký lớp mỏng
Bản mỏng: Silica gel G.
Dung môi khai triển: Petroleum ether (60 – 90 C) : Ethyl formate : Formic acid (15 : 5 : 1).
Dung dịch thử: Lấy khoảng 2 gam bột dược liệu, thêm 30 ml methanol,
đun hoàn lưu 30 phút, lọc, bốc hơi dịch lọc đến cắn, hòa tan cắn trong 2 ml methanol.
Dung dịch đối chiếu: chuẩn bị dung dịch đối chiếu của nấm Linh chi
theo cách tương tự chuẩn bị dung dịch thử.
Tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 4 l mỗi dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Sau khi khai triển, làm khô trong không khí kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm. Tại chỗ huỳnh quang trong sắc ký đồ của dung dịch thử tương ứng về vị trí và màu sắc trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
Tro toàn phần: Không quá 3,2%.
Tro không tan trong acid: Không quá 0,5%.
Bán định lượng kim loại nặng: Không quá 10 ppm chì.
Chất chiết được trong dược liệu: Thực hiện phương pháp chiết nóng để xác định chất chiết được trong dịch chiết nước. Không ít hơn 3%.
Cân chính xác khoảng 2-4 gam bột dược liệu cho vào bình nón 250-300 ml. Thêm chính xác 50-100 ml nước, đậy kín, cân để xác định khối lượng và để yên trong 1 giờ. Sau đó, đun sôi nhẹ dưới hồi lưu trong 1 giờ. Để nguội, lấy bình nón ra, đậy kín, cân để xác định lại khối lượng, thêm nước để bổ sung phần khối lượng bị giảm, lắc mạnh, lọc qua phễu lọc khô vào một bình hứng khô thích hợp. Lấy chính xác 25 ml dịch lọc vào cốc thủy tinh đã cân bì trước, cô trong cách thủy đến cắn khô. Cắn thu được sấy ở 105 C trong 3 giờ, lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân nhanh để xác định khối lượng cắn. Tính phần trăm lượng chất chiết được bằng nước theo dược liệu khô.
Định lượng Polysaccharides: không thấp hơn 0,5%. Chế biến
Quả thể nấm Linh chi sau thu hái được vệ sinh sạch sẽ, phơi khô hoặc sấy ở 40 – 50 C, thường khoảng 3 kg nấm tươi thu được 1 kg nấm khô.
Bảo quản
Có thể đóng gói trong bao PA hút chân không. Bảo quản ở nơi mát, thoáng gió, khô ráo. Định kỳ phải theo dõi nấm mốc, sâu bọ.
Tính vị, quy kinh
Linh chi có vị ngọt hoặc đắng, tính bình, không độc. Quy vào các kinh Tâm, Can, Tỳ, Vị, Phế và Thận.
Công năng, chủ trị
Bổ sung khí huyết và giảm áp lực, làm giảm ho và hen suyễn. Chủ trị: Chóng mặt, mất ngủ, hồi hộp đánh trống ngực, khó thở, ho, hen suyễn.
Sử dụng và liều lượng:
Ngày dùng 6-12 g dược liệu. Kiêng kỵ
Không dùng Linh chi cùng với các vị thuốc “thường sơn”, “biển thanh”, “nhân trần”.
4.4.2 Giải thích tiêu chuẩn
Phần mô tả thực vật, soi bột, định tính bằng sắc ký lớp mỏng, độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid, chất chiết được trong dược liệu, công năng, chủ trị, cách dùng, liều lượng vẫn giữ nguyên theo tiêu chuẩn của Dược điển Trung Quốc 2005.
Bổ sung thêm: Vấn đề nhiễm kim loại nặng trong dược liệu là vấn đề được quan tâm nên khi xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu nấm Linh chi khô đã bổ sung thêm phần Bán định lượng kim loại nặng (tính theo chì), đồng thời bổ sung các phương pháp định tính các nhóm hoạt chất chính, định lượng Polysaccharides thô, chế biến, bảo quản, tính vị, quy kinh, kiêng kỵ.
Trong phần thử độ tinh khiết:
Các chỉ tiêu trên là cần thiết để đảm bảo chất lượng, tính tinh khiết của dược liệu nấm Linh chi khô (không ẩm mốc và lẫn tạp chất), qua đó đánh giá được công tác chế biến, bảo quản đồng thời, tránh các sai số xảy ra khi định tính, định lượng các phần không phải là dược liệu.
Trong phần định tính:
Phần định tính các hoạt chất Triterpenoid, Alkaloid, Saponin, Acid hữu cơ được tiến hành bằng các thuốc thử hóa học theo những phương pháp thử cơ bản dựa vào các dấu hiệu nhận biết đặc trưng, các hoạt chất được xác định là có tồn tại trong nấm Linh chi. Việc xác định các chỉ tiêu này nhằm xác thực lại những hoạt chất có lợi trong nấm Linh chi, đảm bảo cả các loại nấm nghiên cứu đều có hoạt tính tốt khi dùng để làm thuốc và trị bệnh.
Trong phần định lượng:
Công tác xác định hàm lượng Polysaccharides thô trong nấm Linh chi là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng nấm, là một dữ liệu quan trọng cho công tác sử dụng nấm Linh chi làm thuốc. Qua việc khảo sát hàm lượng của 10 loại nấm Linh chi, ta rút ra được kết luận về loại nấm có chứa hàm lượng Polysaccharides cao, từ đó có thể ứng dụng vào việc chọn giống nuôi trồng và sản xuất.
Thực nghiệm được tiến hành theo Qui trình chiết suất polysaccharides
từ nấm Linh chi (Theo Yihuai Gao và ctv, 2001) sử dụng cồn 80% ở nhiệt độ
70C.
Ngoài phương pháp chiết trên, Polysaccharide được tiến hành định lượng bằng phương pháp UV-VIS trong luận văn của bạn Lê Đăng Khoa. Đồng thời, trong luận văn của bạn Bùi Thị Ngọc Hân cũng đã tiến hành định
lượng một hoạt chất quan trọng khác trong nấm Linh chi là Triterpenoid bằng phương pháp UV-VIS.
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận
Dựa trên điều kiện cơ sở và yêu cầu chất lượng, bước đầu đã lựa chọn được được các chỉ tiêu để tiến hành thử nghiệm trên 10 mẫu nấm Linh chi khô trên thị trường và xây dựng bộ tiêu chuẩn.
So với Dược điển Trung Quốc 2005 quy định về nấm Linh chi, đã bổ sung thêm được các tiêu chí đánh giá như: Chế biến, bảo quản, tính vị, quy kinh, kiêng kỵ bán định lượng kim loại nặng (theo chì), các phương pháp định tính nhóm hoạt chất chính, định lượng Polysaccharides thô.
Khảo sát độ ẩm, tro toàn phần, tro không tan trong acid trên 10 mẫu nấm Linh khô đều đạt tiêu chuẩn so với quy định của Dược điển Trung Quốc 2005. Cụ thể như sau:
Độ ẩm: trong khoảng 10,64-14,34% (quy định: không quá 17%). Tro toàn phần: trong khoảng 2,11-2,35% (quy định: không quá
3,2%).
Tro không tan trong acid: trong khoảng 0,21-0,33% (quy định: không quá 0,5%).
Hàm lượng kim loại nặng trong 10 mẫu nấm không vượt quá 10 ppm. Các thành phần dược chất đều hiện diện trong 10 mẫu nấm khảo sát, bao gồm: triterpenoid, saponin, alkaloid, acid hữu cơ.
Trong quả thể 10 mẫu nấm Linh chi có chứa hàm lượng polysaccharides thô trong khoảng 0,71-1,26% so với dược liệu khô kiệt. Khi so sánh kết quả này với kết quả của bạn Lê Đăng Khoa về định lượng polysaccharides trong nấm Linh chi bằng phương pháp UV-VIS, nhận thấy các kết quả có sự chênh lệch nhau. Tuy nhiên, có sự tương đồng về mẫu có hàm lượng polysaccharides cao nhất và thấp nhất. Từ đó cho thấy, định lượng polysaccharides bằng phương pháp chiết ở nhiệt độ thấp cho kết quả khá chính xác. Có thể sử dụng phương pháp này trong trường hợp không có điều kiện kỹ thuật cao mà vẫn có thể xác định được chất lượng của nấm Linh chi, nhận biết được loại nấm có hàm lượng polysaccharides cao từ đó ứng dụng vào việc chọn giống, nuôi trồng và sản xuất.
5.2 Kiến nghị
Đi sâu nghiên cứu về kỹ thuật trồng trọt, thu hái, đặc biệt là công tác chế biến và bảo quản nguyên liệu nấm Linh chi khô để đảm bảo dược liệu
chứa hàm lượng hoạt chất cao, đạt yêu cầu về vệ sinh, an toàn, chất lượng và kéo dài thời gian sử dụng dược liệu.
Tiếp tục nghiên cứu, tiến hành định lượng các nhóm hoạt chất quan trọng trong nấm Linh chi như Alkaloid, Triterpenoid, Germani hữu cơ, ... để góp phần đánh giá chất lượng của các loại nấm Linh chi trên thị trường, nhằm phân biệt thật giả, ổn định thị trường dược liệu sạch trong nước và bảo đảm tính an toàn, hiệu quả cho người sử dụng.
Đẩy mạnh công tác nghiên cứu chiết suất, phân định các nhóm dược chất có lợi đạt hiệu suất cao để làm thuốc, nhằm phát triển ngành dược trong nước lên tầm cao mới, không phụ thuộc vào thị trường nước ngoài.
Bộ tiêu chuẩn trên được xây dựng khá đầy đủ ứng với nhiều nguồn tài liệu tham khảo khác nhau. Tuy nhiên, tùy vào điều kiện kỹ thuật ở mỗi nơi mà các giá trị thử nghiệm, các phương pháp định tính, định lượng, ... sẽ luôn được cập nhật, sửa đổi để phù hợp với sự phát triển của Khoa học kỹ thuật.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
(1) Nguyễn Minh Khang, 2005. Khảo sát sinh trưởng nấm Linh chi đen (Amouroderma subresinosum, Corner) phát hiện tại vùng núi Chứa Chan – Việt Nam. Luận văn kỹ sư chuyên ngành Công nghệ sinh học. Trường đại học Nông Lâm. TP. HCM.
(2) Whittaker R.H., 1996. New concept of a bacterium. Archiv für Mikrobiologie.
(3) Cavalier-Smith T., 1998. A revised six-kingdom system of life. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society – Volume 73, Issue 03.
(4) Nguyễn Như Quỳnh, 2006. Tìm hiểu về một loại nấm Linh chi thu hái tại Thủ HCM. Đức – TPHCM. Luận văn kỹ sư chuyên ngành Công nghệ sinh học. Trường đại học Nông Lâm. TP. HCM.
(5) Nguyễn Lân Dũng, 2002. Công nghệ nuôi trồng nấm – Tập 1, 2. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Hà Nội.
(6) Founder of Gano Excel Mr. Leow Soon Seng. Mushroom of Immortality – Ganoderma lucidum. Gano Excel Team.
(7) Trịnh Tam Kiệt, 2011. Nấm lớn ở Việt Nam – Tập 1. Nhà xuất bản Khoa Học Tự Nhiên Và Công Nghệ. Hà Nội.
(8) Đề tài So sánh một số chủng giống nấm Linh chi [Ganoderma lucidum (W.Curt.:Fr.)Karst.] nuôi trồng ở Hợp tác xã Nông nghiệp Phú Lương 1, huyện Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên – Huế. Luận văn kỹ sư chuyên ngành Sinh học.
(9) PGS. TS. Trương Thị Đẹp, Liêu Hồ Mỹ Trang, Nguyễn Thị Thu Ngân và Nguyễn Thị Thu Hằng, 2011. Phân biệt đặc điểm hình thái – cấu trúc của một số nhóm nấm Linh chi trên thị trường thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu Y học. Tạp chí Y học thành phố Hồ Chí Minh, tập 15, phụ bản của số 1. (10) Lê Công Doanh, 2013. Kỹ thuật bảo quản và chế biến nấm Linh chi. Đồ án tốt nghiệp ngành Công nghệ sinh học. Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh. TP. HCM.
(11) Bài giảng dược liệu – Tập 1, 1998. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật.
(12) Bài giảng dược liệu – Tập 2, 1998. Nhà xuất bản Khoa Học Và Kỹ Thuật.
(13) GS. TS. Đỗ Tất Lợi, 2004. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Xuất bản lần thứ 8. Nhà xuất bản Y học. Hà Nội.
(14) Trương Thị Tuyết Mai. Nghiên cứu một số chế phẩm dược liệu có nguồn gốc từ nấm Linh chi ở Việt Nam. Đồ án chuyên môn ngành Công nghệ sinh học. Trường Cao đẳng Lương Thực – Thực Phẩm.
(15) Nhóm biên soạn Trung tâm Khuyến học quốc gia và Trung tâm Công nghệ sinh học thực vật, 2008. Nấm ăn cơ sở khoa học và công nghệ nuôi trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. Hà Nội.
(16) Dược điển Việt Nam IV, 2010.
(17) Pharmacopoeia of the People’s Republic of China – Vol 1 “Chines Material Medical and Prepared Slices of Chinese Crude Drugs”, 2005. Pharmacopoeia Commission. People’s Medical Publishing House.
(18) Indian Phamacopoeia – Volume III, 2010. The Indian Pharmacopoeia Commission Ghaziabad. Government Of India – Ministry of Health & Family Welfare.
(19) Santanu Saha, E. V. S. Subrahmanyam, Chandrashekar Kodangala and Shashidhara C. Shastry, 2011. Isolation and characterization of triterpanoids and fatty acid ester of triterpenoid from leaves of Bauhinia variegata. Der Pharma Chemica. India.
(20) Yihuai Gao, Guoliang Chen, Jin Lan, He Gao and Shufeng Zhou, 2001. Extraction of Ganoderma polysaccharides at relatively low temperature. Froc Int Symposium Ganoderma Sci, Aukland.
(21) Nguyễn Thị Diệp Chi, 2013. Giáo trình phân tích hiện đại. Bộ môn Hóa, khoa Khoa Học Tự Nghiên, trường Đại học Cần Thơ.
PHỤ LỤC
A. Kết quả gốc các phép đo A.1 Độ ẩm
Bảng A.1: Kết quả đo độ ẩm
Mẫu m0 (g) m1 (g) m2 (g) Độ ẩm (%) Độ ẩm trung bình (%) 1 1A 51,6708 52,6810 52,5578 12,20 12,11 1B 51,8096 5,81050 52,6882 12,22 1C 53,2997 54,3035 54,1817 12,13 1D 47,9030 48,9368 48,8138 11,90 2 2A 47,0339 48,0497 47,9201 12,76 12,55 2B 47,7526 48,7665 48,6389 12,59 2C 66,0021 67,0037 66,8784 12,51 2D 66,0442 67,0533 66,9288 12,34 3 3A 47,2251 48,2301 48,0844 14,50 14,28 3B 65,9446 66,9533 66,8103 14,18 3C 34,5168 35,5378 35,3935 14,13 3D 46,7455 47,7435 47,6009 14,29 4 4A 69,6132 70,6227 70,4789 14,24 14,34 4B 47,9798 48,9768 48,8321 14,51 4C 57,9481 58,9519 58,8075 14,39 4D 51,7079 52,7676 52,6171 14,20 5 5A 44,2682 45,2671 45,1533 11,39 11,54 5B 47,4830 48,4833 48,3672 11,61 5C 48,3028 49,3981 49,2730 11,42 5D 46,7329 47,7576 47,6374 11,73 6 6A 51,6659 52,6761 52,5476 12,72 12,56 6B 51,8115 52,8178 52,6896 12,74 6C 53,2993 54,3182 54,1913 12,45 6D 47,9075 48,9077 48,7843 12,34 7 7A 44,2682 45,2712 45,1309 13,99 14,01 7B 47,4831 48,4968 48,3539 14,10 7C 48,3031 49,3243 49,1807 14,06 7D 46,7366 47,7551 47,6138 13,87 8 8A 47,0334 48,0371 47,9311 10,56 10,64 8B 47,7491 48,7513 48,6447 10,64 8C 66,0003 66,9993 66,8928 10,66 8D 66,0415 67,0581 66,9494 10,69
9 9A 47,2258 48,2385 48,1024 13,44 13, 67 9B 65,9410 66,9651 66,8233 13,85 9C 34,5196 35,5225 35,3856 13,65 9D 46,7417 47,7664 47,6257 13,73 10 10A 69,6146 70,6224 70,4847 13,66 13,41 10B 47,9798 48,9807 48,8451 13,55 10C 57,9473 58,9557 58,8234 13,12 10D 51,7080 52,7218 52,5871 13,29 Với:
m0: khối lượng cốc cân bì (g).
m1: khối lượng cốc và dược liệu trước khi nung (g). m2: khối lượng cốc và dược liệu sau khi nung (g).
A.2 Tro toàn phần
Bảng A.2 Kết quả nung tro toàn phần
Mẫu a m P b % Tro TB tro(%)
1 1A 22,0717 22,9617 0,8900 22,0903 2,09 2,11 1B 22,1362 23,0155 0,8793 22,1548 2,12 1C 20,8376 21,7197 0,8821 20,8564 2,13 1D 22,1075 23,0185 0,9110 22,1266 2,10 2 2A 21,9986 22,8847 0,8861 22,0187 2,27 2,31 2B 20,8350 21,7216 0,8866 20,8555 2,31 2C 36,9997 37,8764 0,8767 37,0200 2,32 2D 40,0633 40,9477 0,8844 40,0838 2,32 3 3A 35,0597 35,9190 0,8593 35,0789 2,23 2,21 3B 35,9023 36,7683 0,8660 35,9214 2,21 3C 37,0006 37,8771 0,8765 37,0199 2,20 3D 35,9023 36,7578 0,8555 35,9212 2,21 4 4A 35,0590 35,9251 0,8661 35,0775 2,14 2,14 4B 33,7380 34,5905 0,8525 33,7561 2,12 4C 40,0640 40,9239 0,8599 40,0826 2,16 4D 31,4490 32,3580 0,9090 31,4683 2,12 5 5A 35,9256 36,8114 0,8858 35,9454 2,24 2,25 5B 36,9990 37,8837 0,8847 37,0190 2,26 5C 33,7398 34,7098 0,9700 33,7616 2,25 5D 35,0584 35,9632 0,9048 35,0788 2,25 6 6A 37,0001 37,8821 0,8820 37,0207 2,34 2,35 6B 35,9020 36,7803 0,8783 35,9228 2,37 6C 40,0644 40,9566 0,8922 40,0853 2,34 6D 33,7384 34,6155 0,8771 33,7590 2,35 7 7A 31,4494 32,3121 0,8627 31,4678 2,13 2,14 7B 35,0589 35,9299 0,8710 35,0776 2,15
7C 40,0638 41,0413 0,9775 40,0847 2,14 7D 36,9995 37,8772 0,8777 37,0182 2,13 8 8A 33,7379 34,6361 0,8982 33,7575 2,18 2,2 8B 35,9022 36,7981 0,8959 35,9219 2,20 8C 35,0593 35,9523 0,8930 35,0790 2,21 8D 31,4492 32,3573 0,9081 31,4693 2,21 9 9A 40,0645 40,9409 0,8764 40,0831 2,12 2,12 9B 37,0005 37,8833 0,8828 37,0192 2,12 9C 33,7388 34,6051 0,8663 33,7569 2,09 9D 35,9018 36,7858 0,8840 35,9206 2,13 10 10A 35,0591 35,9929 0,9338 35,0804 2,28 2,3 10B 31,4493 32,3146 0,8653 31,4692 2,30 10C 40,0648 40,9414 0,8766 40,0851 2,32 10D 36,9997 37,8792 0,8795 37,0198 2,29 Với:
a: Khối lượng cốc đã cân bì (g).
m: Khối lượng cốc và dược liệu trước khi nung (g). P = m – a: Khối lượng dược liệu khô trong không khí (g).