d) Đề nghị và điểm:
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm
Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Hóa học đại cương A3, khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
3.1.2 Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 8/2013 đến tháng 12/2013.
3.1.3 Đối tượng nghiên cứu
Nấm Linh chi khô do Công ty Cổ phần Dược Hậu Giang cung cấp, được mua từ nhiều nguồn trong nước.
3.1.4 Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm Tủ sấy Tủ sấy Lò nung Bể điều nhiệt Thiết bị rửa dụng cụ Cốc sứ
Cốc thủy tinh các loại Mặt kính đồng hồ Bình hút ẩm
Ống nghiệm các loại
3.1.5 Hóa chất
Thuốc thử Mayer (K2HgI4), Thuốc thử Dragendorff (KbiI4), HCl, NaOH, diethylether, ethanol, H2SO4 đậm đặc, anhydride acetic, NH3 đậm đặc, NaHCO3, MgO, acid acetic băng, dung dịch dithizon, giấy lọc Whatman 44.
3.2 Tiến hành thực nghiệm
Dựa trên những chỉ tiêu đã lựa chọn, tiến hành khảo sát trên 10 mẫu nấm Linh chi khô.
3.2.1 Lấy mẫu dược liệu
Nấm Linh chi khô gồm 10 mẫu được lấy về từ Công ty cổ phần dược Hậu Giang ngày 08/08/2013 có hình dáng và khối lượng như sau:
Hình 3.1: Mười mẫu nấm Linh chi
Trong đó, được biết mẫu 6 là Linh chi VINA (Ganoderma lucidum) là giống Linh chi Việt Nam được mua từ TP.HCM và mẫu 10 là Linh chi TG (Ganoderma lucidum) được trồng ở Tiền Giang.
Mẫu lấy về được bảo quản trong bao bì kín, nguyên vẹn, sạch sẽ được chia thành mảnh nhỏ có đường kính không quá 3 mm. Bảo quản ở nơi khô ráo và thoáng mát. Khi tiến hành thí nghiệm, trộn đều và tạo mẫu đồng nhất bằng cách: San bằng mẫu thành hình vuông, chia mẫu theo 2 đường chéo thành 4 phần bằng nhau. Lấy 2 phần đối diện và trộn đều. Làm lại thao tác chia 4 cho đến khi thu được số lượng vừa đủ để làm mẫu thử và mẫu lưu.
Cân một phần mẫu vừa đủ để xay thành bột, rây và trộn đều để sử dụng cho phần định tính.
3.2.2 Thí nghiệm khảo sát các chỉ tiêu về độ tinh khiết 3.2.2.2 Xác định độ ẩm 3.2.2.2 Xác định độ ẩm
(Không quá 17% theo Dược điển Trung Quốc 2005, phụ lục IX H)
Tiến hành:
Dùng cốc thủy tinh rộng miệng đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử. Làm khô bì trong tủ sấy đến khi khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng bì. Cân ngay vào bì này 1 g mẫu nấm đã được làm nhỏ, mẫu thử được dàn mỏng thành lớp có độ dày không quá 5 mm. Sấy cốc chứa mẫu trong tủ sấy với nhiệt độ 105 C trong 5 giờ. Sau khi sấy, làm nguội trong bình hút ẩm có silicagel trong 30 phút rồi cân ngay. Tiếp tục sấy cốc với cùng điều kiện trên trong 1 giờ, làm nguội và cân. Lặp lại các thao tác cho đến khi chênh lệch khối lượng giữa hai lần cân không quá 5 mg. Tính độ ẩm (H%) dựa vào sự giảm khối lượng do sấy theo công thức:
100 (%) 1 2 m m m m H
Với: m0: khối lượng cốc thủy tinh (g).
m1: khối lượng chén sứ và dược liệu nấm Linh chi khô trước khi sấy (g).
m2: khối lượng chén sứ và dược liệu nấm Linh chi khô sau khi sấy (g).
3.2.2.3 Xác định tro toàn phần
(Không quá 3.2% theo Dược điển Trung Quốc 2005, phụ lục IX K)
Tiến hành:
Cho 1 g mẫu vào một cốc sứ có nắp đậy đã nung và cân bì. Đun cốc trên bếp điện cho đến khi không còn khói trắng thoát ra. Sau khi đun, nung cốc trong tủ nung ở nhiệt độ 600 C cho đến khi khối lượng không đổi, để nguội và cân. Tính toán tỷ lệ phần trăm tro so với dược liệu khô trong không khí (X%) theo công thức:
Với: a: khối lượng cốc sứ (g).
P: khối lượng dược liệu nấm Linh chi khô (g).
b: khối lượng cốc sứ và dược liệu nấm Linh chi khô sau khi nung (g).
H: độ ẩm dược liệu nấm Linh chi khô (%).
3.2.2.4 Xác định tro không tan trong acid
(Không quá 0.5% theo Dược điển Trung Quốc 2005, phụ lục IX K)
Tiến hành:
Cho tro toàn phần vào một chén nung, thêm cẩn thận 10 ml HCl loãng. Đậy chén bằng một mặt kính đồng hồ, rửa mặt kính với 5 ml nước nóng rồi cho vào chén nung. Lọc dịch bằng một giấy lọc không tro, rửa bằng nước nóng tới khi dịch lọc cho phản ứng trung tính. Làm khô rồi nung tới đỏ tối, để nguội trong bình hút ẩm rồi cân. Nung tiếp tới khi giữa 2 lần cân khối lượng chênh lệch nhau không quá 1 mg. Tính tỷ lệ phần trăm của tro không tan trong acid so với dược liệu đã được làm khô trong không khí (T%) theo công thức:
Với: c: khối lượng cốc sứ (g). 10000 100 (%) H P a b X 100 (%) P c d T
d: khối lượng cốc sứ và tro không tan trong acid sau khi nung (g) P: khối lượng dược liệu nấm Linh chi khô (g).
3.2.2.5 Bán định lượng nồng độ kim loại nặng
Bán định lượng kim loại nặng (tính theo chì) trong nấm Linh chi bằng cách: Dùng dung dịch chì chuẩn 10 ppm tạo phức màu với thuốc thử dithizone trong môi trường pH 5-6, so sánh với màu dung dịch dược liệu nấm Linh chi khô chuẩn bị trong cùng điều kiện.
Tiến hành:
Chuẩn bị dung dịch thử:
Trộn đều 1 gam dược liệu nấm Linh chi khô với 0,5 gam MgO trong một cốc sứ. Nung đỏ hỗn hợp trên bến điện cho đến khi thu được một khối đồng nhất màu xám nhạt, sau đó nung trong lò nung ở 800 C trong 1 giờ.
Hòa tan cắn, dùng 10 ml dung dịch acid hydrochloric 5 N, sau đó thêm 0,1 ml phenolphthalein, rồi cho dung dịch amoniac đậm đặc đến khi có màu hồng.
Để nguội, cho acid acetic băng đến khi mất màu dung dịch, rồi thêm 0,5 ml nữa. Lọc, rồi pha loãng dung dịch với nước thành 20 ml. Lấy 12 ml dung dịch thu được ở trên cho vào một ống nghiệm.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: Lấy 2 ml dung dịch chì 10 ppm, cho vào một
chén nung silica, trộn với 0,5 gam MgO. Làm khô hỗn hợp trong tủ sấy ở 105 C. Sau đó, đun trên bếp điện, các giai đoạn sau tiến hành tương tự như chuẩn bị dung dịch thử.
So màu: Thêm 1,2 ml dung dịch dithizone vào dung dịch thử và dung
dịch chuẩn, lắc đều rồi rồi yên 2 phút. So màu ống chuẩn chứa dung dịch chì 10 ppm với ống nghiệm chứa dung dịch chế phẩm thử.
3.2.3 Thí nghiệm định tính dược chất có trong nấm Linh chi
3.2.3.1 Định tính Triterpenoid (bằng phản ứng Liebermann – Burchard)
Chiết 1 gam bột dược liệu bằng diethylether lắc trong bình nón, trong 15 phút, chiết cho tới khi dịch ether sau khi bốc hơi không còn để lại lớp cắn mờ trên mặt kính đồng hồ, gộp các dịch chiết, lọc và cô lại đến khi còn khoảng 50 ml dịch chiết ether.
Lấy 5 ml dịch chiết ether cho vào chén sứ, bốc hới tới cắn. Hòa tan cắn với 0,5 ml chloroform, rồi thêm vào 0,5 ml anhydride acetic. Chuyển dung
dịch vào 1 ống nghiệm nhỏ khô, dùng pipet pasteur thêm cẩn thận vài giọt H2SO4 đậm đặc lên thành ống nghiệm để nghiên cho acid chảy xuống đáy ống nghiệm. Nơi tiếp xúc giữa 2 lớp dung dịch có màu đỏ nâu hay đỏ đến tím, lớp phía dung dịch trên dần dần chuyển thành màu xanh lục. Kết luận có Triterpenoid.
3.2.3.2 Định tính Saponin
Chiết 2 gam dược liệu với cồn 70% bằng cách ngâm trong 24 giờ rồi lọc. Cô dịch lọc bốc hơi đến cắn khô. Dùng cắn để làm các phản ứng định tính.
Thử nghiệm tính tạo bọt
Cách tiến hành: Hòa tan một lượng cắn tương ứng với 1 gam dược liệu
vào 5 ml nước nóng. Lọc vào một ống nghiệm 16 cm và để nguội, thêm nước cho đủ 10 ml, dùng ngón tay cái bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm trong 1 phút (khoảng 30 lần lắc). Để yên ống nghiệm, quan sát lớp bọt và đánh giá kết quả:
Bọt bền trong 15 phút: + Bọt bền trong 30 phút: ++ Bọt bền trong 60 phút: +++
Xác định thành phần Saponin
Lấy một lượng cắn tương ứng với 1 gam bột dược liệu, đun nóng nhẹ trên cách thủy để hòa tan với 10 ml nước. Chia đều vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: thêm 2 ml HCl 0.1N (pH =1) Ống 2: thêm 2 ml NaOH 0.1N (pH =13)
Bịt miệng ống nghiệm và lắc mạnh theo chiều dọc cả 2 ống trong 1 phút và để yên, quan sát các cột bong bóng trong cả 2 ống nghiệm.
Nếu cột bọt trong cả 2 ống cao ngang nhau và bền như nhau, thì sơ bộ xác định là có saponin triterpenoid.
Nếu ống pH = 13 có cột bọt cao hơn nhiều so với ống pH = 1, sơ bộ xác định là có saponin steroid.
3.2.3.3 Định tính Alkaloid
Chuẩn bị dịch thử :
Xác định sự hiện diện của Alkaloid trong dược liệu với cách thử như sau: Lấy 1 gam bột nấm Linh chi xay nhuyễn và 20 ml dung dịch 1% H2SO4 cho vào erlen, đun nhẹ trong 1 giờ. Lọc lấy dịch lọc để thử nghiệm với thuốc thử Mayer và Dragendorff. Quan sát kết tủa, nếu có kết tủa theo qui định là dương tính.
Thuốc thử Mayer: Hòa tan 1,36 gam HgCl2 trong 60 ml nước cất và 5 gam KI trong 10 ml nước cất. Thu hỗn hợp 2 dung dịch này lại và thêm nước cất cho đủ 100 ml.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu trắng hoặc vàng nhạt. Cần lưu ý vì tủa tạo thành có thể hòa tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hòa tan bởi ethanol có sẵn trong dung dịch thử.
Thuốc thử Dragendorff: Hòa tan 8 gam Nitrat bismuth Bi(NO3)3 trong 25 ml HNO3 30% (D = 1,18). Hòa tan 28 gam KI và 1 ml HCl 6N trong 5 ml nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch này lại để yên trong tủ lạnh 5 C sẽ thấy tủa màu sậm xuất hiện và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100 ml. Dung dịch màu cam đỏ được chứa trong chai màu nâu để che sáng, giữ trong tủ lạnh, có thể giữ lâu vài tuần.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào dung dịch acid loãng có chứa alkaloid, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam – nâu.
3.2.3.4 Định tính Acid hữu cơ
Lấy 2 ml dịch chiết nước cho vào một ống nghiệm. Thêm vào dung dịch một ít tinh thể natri NaHCO3. Nếu có các bọt khí nhỏ sủi lên từ các tinh thể NaHCO3 thì kết luận là có acid hữu cơ.
3.2.4 Thí nghiệm định lượng Polysaccharide thô
Polysaccharide có nhiều dạng và nhiều qui trình chiết khác nhau. Chiết GLPs ở 100 C trong 16 giờ, cho năng suất ly trích cao, nhưng làm biến đổi cấu trúc sinh học các polysaccharides có trong nấm Linh chi. Một qui trình thứ hai được ứng dụng rộng rãi để chiết các GLPs ở nhiệt độ thấp, nhằm ổn định cấu trúc sinh học của các GLPs.
Qui trình chiết xuất polysaccharides từ nấm Linh chi (Yihuai Gao và cộng sự, 2001):
Hình 3.2:Quy trình chiết xuất Polysaccharides
Thu nhận cả 3 dịch chiết và lọc. Thu phần cặn, sấy khô và cân trọng lượng. Từ đó đánh giá hàm lượng polysaccharide thô có trong quả thể nấm Linh chi.
Quả thể nấm Linh chi
Thái mỏng Hỗn hợp chiết rút lần 1 Bã chiết lần 1 Hỗn hợp chiết rút lần 2 Bã chiết lần 2 Dịch chiết lần 3 Dịch chiết lần 1 Dịch chiết lần 2
Ngâm nước 70 C trong 3 giờ
Ngâm nước 70 C trong 3 giờ
Ngâm cồn 80% ở 70 C trong 2 giờ
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả khảo sát các chỉ tiêu về độ tinh khiết 4.1.1 Độ ẩm 4.1.1 Độ ẩm
Sau khi tiến hành thực nghiệm, ta thu được kết quả độ ẩm của 10 mẫu nấm Linh chi như sau:
Bảng 4.1: Kết quả đo độ ẩm Mẫu Độ ẩmSD (%) 1 12,110,15 2 12,550,17 3 14,280,16 4 14,340,14 5 11,540,16 6 12,560,20 7 14,010,34 8 10,640,01 9 13,670,17 10 13,410,25
(SD (Standard Deviation): Độ lệch chuẩn theo phương pháp phân tích Thống kê mô tả (Descriptive Statistics) chương trình Excel.)
Nhận xét:
Thực nghiệm đo độ ẩm trên 10 mẫu nấm Linh chi khô thu được kết quả trong khoảng 10,64-14,34%, đạt tiêu chuẩn so với quy định của Dược điển Trung Quốc 2005 (không quá 17%).
Có sự khác lệch giữa các kết quả là do mỗi loại nấm có nguồn gốc khác nhau (được thu mua từ nhiều nguồn trong nước, điều kiện môi trường khác nhau, công tác chế biến và bảo quản khác nhau), nên mức độ khô kiệt và nhiễm ẩm trở lại khác nhau, tuy nhiên ở độ ẩm này các mẫu nấm chưa bị ẩm mốc và hư hại.
Trong quá trình xử lý mẫu (cắt mẫu, trộn và chọn mẫu) không thể tránh khỏi một số ảnh hưởng từ tự nhiên như nhiệt độ, độ ẩm không khí trong mùa mưa, ... Tuy nhiên, thao tác nhanh chóng và công tác bảo quản nghiêm ngặt ở nơi khô ráo, thoáng mát, trong bao nilon kín, đảm bảo mẫu ít bị ảnh hưởng nhất từ môi trường, không ảnh hưởng lớn đến kết quả.
4.1.2 Tro toàn phần
Sau quá trình nung tro, ta thu được kết quả Tro toàn phần của 10 mẫu nấm Linh chi như sau:
Bảng 4.2: Kết quả Tro toàn phần
Mẫu Tro toàn phầnSD (%)
1 2,110,02 2 2,310,02 3 2,210,01 4 2,140,02 5 2,250,01 6 2,350,01 7 2,140,01 8 2,200,01 9 2,120,02 10 2,300,02
(SD (Standard Deviation): Độ lệch chuẩn theo phương pháp phân tích Thống kê mô tả (Descriptive Statistics) chương trình Excel.)
Nhận xét:
Thực nghiệm nung Tro toàn phần của 10 mẫu nấm Linh chi khô thu được kết quả trong khoảng 2,11-2,35%, đạt tiêu chuẩn so với quy định của Dược điển Trung Quốc 2005 (không quá 3,2%).
Các kết quả khá tương đồng nhau và đều đạt tiêu chuẩn, có thể thấy tro tổng số không hiện diện nhiều làm giảm đi chất lượng của dược liệu.
4.1.3 Tro không tan trong acid
Sau quá trình tiến hành, ta thu được kết quả Tro không tan trong acid của 10 mẫu nấm Linh chi như sau:
Bảng 4.3: Kết quả Tro không tan trong acid
Mẫu Tro không tan trong acidSD (%)
1 0,240,01 2 0,310,02 3 0,210,01 4 0,290,01 5 0,280,02 6 0,320,02 7 0,250,02 8 0,300,01 9 0,300,02 10 0,330,01
(SD (Standard Deviation): Độ lệch chuẩn theo phương pháp phân tích Thống kê mô tả
(Descriptive Statistics) chương trình Excel.) Nhận xét:
Thực nghiệm tiến hành nung Tro không tan trong acid trên 10 mẫu nấm Linh chi khô thu được kết quả trong khoảng 0,21-0,33%, đạt tiêu chuẩn so với quy định của Dược điển Trung Quốc 2005 (không quá 0,5%).
Kết quả cho thấy hàm lượng Tro không tan trong acid (cũng như tro toàn phần) không vượt chuẩn, có thể kết luận 10 mẫu nấm đều không bị nhiễm bẩn, ko lẫn nhiều đất cát, đảm bảo dược liệu sạch.
4.1.4 Bán định lượng nồng độ kim loại nặng
Thêm dung dịch dithizone vào dung dịch thử và dung dịch chuẩn, lắc đều rồi rồi yên 2 phút. Nhận thấy dung dịch dithizone màu xanh lá đậm kết hợp với chì tạo ra phức chì – dithizonat có màu đỏ. So màu ống chuẩn chứa dung dịch chì 10 ppm với ống nghiệm chứa dung dịch chế phẩm thử, thấy ống chứa dung dịch chuẩn chì 10 ppm có màu sậm hơn nhiều so với ống chứa dung dịch thử.
Hình 4.1: Kết quả so màu phức chì – dithizonat
Ống 1: Ống chứa dung dịch chuẩn chì 10 ppm + dithizone Ống 2: Ống chứa dung dịch chế phẩm thử + dithizone
Kết luận: Hàm lượng kim loại nặng trong 10 mẫu nấm Linh chi khảo sát không quá 10 ppm.
4.2 Kết quả định tính các hoạt chất
Tiến hành định tính các nhóm hoạt chất chính trên dịch chiết 10 mẫu nấm Linh chi khô thu được kết quả như sau:
Bảng 4.4: Kết quả định tính nhóm hoạt chất chính
Nhóm hoạt chất Kết quả định tính trên mười mẫu nấm
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 Triterpenoid (++) (++) (+) (++) (+) (+) (++) (+) (+) (++) Saponin Steroid (+) (+) (+) (++) (++) (+) (+++) (+++) (+++) (+) Alkaloid TT Mayer (++) (+) (+) (+++) (+++) (+) (+) (+) (+) (+) TT Dragendorff (+) (++) (+++) (++) (+) (+) (+) (+) (++) (+++) Acid hữu cơ (+) (+) (+) (++) (+) (+) (+) (+) (+) (+)
(-): Không (+): Có (++): Có nhiều (+++): Có rất nhiều Nhận xét:
Theo kết quả ở Bảng 4.4 ta thấy có sự hiện diện của triterpenoid, saponin steroid, alkaloid, acid hữu cơ trên tất cả 10 mẫu nấm khảo sát.
Trong đó, nổi bật với Mẫu 4 cho kết quả định tính cả 4 hoạt chất rõ nét nhất, có thể kết luận mẫu này chứa thành phần dược chất cao nhất trong 10 mẫu nấm Linh chi.
Bên cạnh đó, Mẫu 6 được xem là cho kết quả mờ nhạt nhất trong các