L ỜI MỞ ĐẦU
5.1.Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
5.1.1. Vật liệu
5.1.1.1. Chủng vi sinh vật
Bao gồm những vi khuẩn:
• Bacillus subtilis: trực khuẩn gram (+), sinh bào tử, thường không gây bệnh.
• Escherichia coli: vi khuẩn gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hóa như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực tuyến.
Chủng vi khuẩn: được bảo quản và giữ giống trong môi trường MPA
5.1.1.2. Hóa chất + Phức chất Ni (II) – 5-BSAT + Phức chất Cd (II) – 5-BSAT + Dung môi DMF + Cồn 960 + Cồn 700 + NaCl khan + Pepton + Cao thịt + Agar + Nước cất 2 lần 5.1.1.3. Dụng cụ thí nghiệm + Đĩa petri
+ Que trong tam giác
+ Que cấy tròn
+ Cây đục lỗ thạch
+ Que tam giác lấy thạch
+ Pipetment màu vàng + Đầu tiếp vàng + Cốc 250ml + Cốc 100ml + Bình tam giác + Ống nghiệm + Đèn cồn + Nồi nhôm
+ Bông gòn, giấy báo
5.1.1.4. Thiết bị thí nghiệm + Tủ sấy. + Nồi áp suất + Tủ cấy + Tủ lạnh + Cân phân tích (4 số)
5.1.2. Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành khảo sát hoạt tính của các hợp chất tổng hợp được bằng phương pháp“khoan lỗ thạch”.
Phương pháp khoan lỗ thạch (đục lỗ thạch): là phương pháp thử hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn trong dung dịch. Vi sinh vật chỉ thị được trải một lớp mỏng trên bề mặt môi trường MPA agar, dùng khoan nút chai khoan lỗ trên bề mặt thạch đã cấy vi khuẩn trong đĩa petri. Nhỏ vào mỗi lỗ thạch phức chất cần thử hoạt tính, đem ủ trong tủ lạnh từ 4 – 8h, sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh 12h
, xem kết quả. Nếu chất có khả năng kháng khuẩn thì nó sẽ ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn và hình thành một vòng gọi là vòng kháng khuẩn (hay vòng vô khuẩn), đo đường kính của vòng kháng khuẩn ta có thể định tính được khả năng kháng khuẩn của chất cần nghiên cứu với vi khuẩn mà ta cấy vào môi trường.
Hình 5.1. Hình ảnh về các chủng khuẩn và đường kính kháng khuẩn
Lưu ý:
• Để xác định được vòng kháng khuẩn thực khi sử dụng phương pháp này để thủ hoạt tính sinh học, bề dày môi trường petri cần phải được chuẩn hóa. Môi trường quá dày sẽ ngăn cản khả năng khuếch tán của các chất kháng khuẩn trong thạch. Nồng độ vi khuẩn chỉ thị cũng ảnh hưởng lên độ trong suốt của vòng kháng khuẩn. Có nghĩa là có sự tương ứng giữa chất kháng khuẩn với mật độ tế bào vi khuẩn chỉ thị, sau khi thử nghiệm phương pháp với độ dày khác nhau thì độ dày 3mm tương ứng với 15 ml môi trường thạch là thích hợp. Nồng độ vi khuẩn chỉ thị khoảng 105 tế bào/ml là phù hợp.
• Đường kính vòng kháng khuẩn được đo bao gồm cả đường kính giếng thạch. Vì vậy, ta có công thức tính đường kính vành kháng khuẩn:
Đường kính vành kháng khuẩn = [d vòng kháng – d giếng thạch] (mm).
• Nếu dung môi pha phức chất cũng có tính kháng khuẩn thì đường kính thật vành kháng khuẩn được tính:
Đường kính vành kháng khuẩn = [d vòng kháng của phức rắn – d vòng kháng của dung môi] (mm)
Một số tiêu chuẩn về đường kính của vòng vô khuẩn
D – d ≥ 25 mm chất kháng khuẩn rất mạnh (++++) 20 ≤ D – d ≤ 25 mm chất kháng khuẩn mạnh (+++) 15 ≤ D – d ≤ 20 mm chất kháng khuẩn trung bình (++) 0 < D – d ≤ 15 mm chất kháng khuẩn yếu (+)
D – d = 0 chất không kháng khuẩn Trong đó: D là đường kính vòng vô khuẩn (mm).
d là đường kính khối thạch (mm).
5.2. Điều kiện thử hoạt tính
Hoạt tính kháng khuẩn của các chất được thử nghiệm tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh bằng phương pháp “đục lỗ thạch”.
5.3. Môi trường nghiên cứu
MPA Agar, thành phần: 5 g cao thịt, 5 g peptone, 5 g NaCl khan, 20 g Agar, 1000 ml nước cất.
Môi trường MPA có pH = 7.
5.4. Cách tiến hành
5.2.1. Chuẩn bị dụng cụ
Rửa đĩa, để ráo, sấy khô ở 1000C trong 1 giờ. Sau 1 giờ, lấy đĩa ra khỏi tủ sấy, để nguội, gói lại bằng giấy báo (6 đĩa/gói), sấy vô trùng ở 1800
C trong 1 giờ. Hấp vô trùng: đầu tiếp vàng, 2 ống nghiệm chứa 9 ml nước cất, 2 cốc không để đựng cồn.
5.2.2. Chuẩn bị môi trường MPA
Cân chính xác 5g NaCl, 5g pepton, 5g cao thịt và 20g agar, sau đó thêm vào 1 lít nước cất 2 lần. Khuấy đều hỗn hợp, sau đó đun trên bếp điện (chú ý chỉ đun gầm sôi, không để sôi), đổ hỗn hợp này vào bình tam giác (150ml/bình). Đậy miệng bình bằng nút bông gòn, quấn giấy báo xung quanh miệng bình sau đó đem đi hấp vô trùng trong 30 phút bằng máy áp suất thấp.
5.2.3. Chuẩn bị hóa chất
Dung dịch phức Ni – 5-BSAT 1%: 0,0211g Ni (II) – 5-BSAT + 2,1102g dung dịch DMF.
Dung dịch phức Ni – 5-BSAT 2%: 0,0210g Ni (II) – 5-BSAT + 1,0508g dung dịch DMF.
Dung dịch phức Cd – 5-BSAT 1%: 0,0213g Cd (II) – 5-BSAT + 2,1310g dung dịch DMF.
Dung dịch phức Cd – 5-BSAT 2%: 0,0209g Pb (II) – 5-BSAT + 1,0458g dung dịch DMF.
5.2.4. Đổ môi trường MPA
Hỗn hợp môi trường sau khi đã hấp vô trùng được đưa vào tủ cấy, mở nút bông, hở nóng cổ và miệng bình trên ngọn lửa đèn cồn rồi rót vào các đĩa petri đã được hấp vô trùng một lớp có độ dày vừa đủ. Để trong tủ cấy cho thạch đông lại, sau đó gói vào giấy báo (3 đĩa/gói) và để đông trong vòng 24 giờ.
5.2.5. Cấy vi khuẩn và chất cần thử hoạt tính sinh học
Cấy trải vi khuẩn Bacillus subtilis và Escherichia coli lên môi trường MPA trong đĩa petri. Dùng khoan nút chai khoan một lỗ giữa đĩa.
Hút 0,1ml chất ở các nồng độ với nồng độ 1%, 2% cho vào lỗ khoan.
Đặt mẫu trong tủ lạnh từ 3 – 4 giờ, ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ, sau đó đo đường kính vòng vô khuẩn (mm).
Hình 5.2. Đường kính vô khuẩn của Cd – 5-BSAT 1% với vi khuẩn Bacillus
Hình 5.3. Đường kính vô khuẩn của Cd – 5-BSAT 2% với vi khuẩn Bacillus
Hình 5.4. Đường kính vô khuẩn của Ni – 5-BSAT 1% với vi khuẩn Bacillus
Hình 5.6. Đường kính vô khuẩn của Cd – 5-BSAT 1% với vi khuẩn E.Coli
Hình 5.7. Đường kính vô khuẩn của Cd – 5-BSAT 2% với vi khuẩn E.Coli
Hình 5.8. Đường kính vô khuẩn của Ni – 5-BSAT 1% với vi khuẩn E.Coli
Hình 5.9. Đường kính vô khuẩn của Ni – 5-BSAT 2% với vi khuẩn E.Coli
Bảng 5.1. Đường kính vô khuẩn của các chất Vi khuẩn
Chất
Escherichia Coli Bacillus Subtilis
1% 2% 1% 2%
DMF 1,2 cm 1,2 cm 1,1 cm 1,1 cm Ni – 5-BSAT 0,6 cm 0,4 cm 2,2 cm 1,9 cm Cd – 5-BSAT 1,0 cm 0,8 cm 2,6 cm 2,7 cm
Bảng 5.2. Khả năng kháng khuẩn của các phức Vi khuẩn
Chất
Escherichia Coli Bacillus Subtilis
1% 2% 1% 2%
DMF + + + +
Ni – 5-BSAT + + +++ +++
Cd – 5-BSAT + + +++ +++
Nhận xét:
Đường kính vô khuẩn của Ni – 5-BSAT
• Đối với vi khuẩn Escherichia Coli
+ Nồng độ 1%: 0 < D – d = 6 ≤ 15 mm ⇒ kháng khuẩn yếu.
+ Nồng độ 2%: 0 < D – d = 4 ≤ 15 mm ⇒ kháng khuẩn yếu.
• Đối với vi khuẩn Bacillus Subtilis
+ Nồng độ 1%: 20 < D – d = 22 ≤ 25 mm ⇒ kháng khuẩn mạnh.
+ Nồng độ 2%: 20 < D – d = 19 ≤ 25 mm ⇒ kháng khuẩn mạnh. Đường kính vô khuẩn của Cd – 5-BSAT
• Đối với vi khuẩn Escherichia Coli
+ Nồng độ 1%: 0 < D – d = 10 ≤ 15 mm ⇒ kháng khuẩn yếu.
+ Nồng độ 2%: 0 < D – d = 8 ≤ 15 mm ⇒ kháng khuẩn yếu.
• Đối với vi khuẩn Bacillus Subtilis
+ Nồng độ 1%: 20 < D – d = 26 ≤ 25 mm ⇒ kháng khuẩn mạnh.
+ Nồng độ 2%: 20 < D – d = 17 ≤ 25 mm ⇒ kháng khuẩn mạnh.
⇒Kết luận chung:
• Ni – 5-BSAT và Cd – 5-BSAT đều kháng khuẩn Bacillus Subtilis mạnh và kháng khuẩn Escherichia Coli yếu.
• Khả năng kháng khuẩn của Cd – 5-BSAT mạnh hơn Ni – 5-BSAT đối với cả hai loại vi khuẩn Bacillus Subtilis và Escherichia Coli.
PHẦN
KẾT LUẬN VÀ
1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
+ Đã tổng hợp được thuốc thử 5 – BSAT với hiệu suất là 53,31%.
+ Đã tổng hợp được phức rắn Ni(II) – 5-BSAT, Cd (II) – 5-BSAT. Dựa vào FT – IR và H – NMR, chúng tôi khẳng định có các phức trên tạo thành.
+ Dựa vào kết quả phổ thực nghiệm và các kết quả công trình nghiên cứu khoa học trước đây, chúng tôi đề nghị công thức của các phức Ni (II) – 5- BSAT và Cd (II) – 5-BSAT :
N NH NH2 S N N H N H2 S Ni O H Br OH Br N NH NH2 S N N H N H2 S Cd O H OH Br Br
+ Đã thăm dò hoạt tính sinh học của dung dịch muối Ni(II) và Cd(II) với thuốc thử 5 – BSAT với vi khuẩn Bacillus Subtilis và Escherichia Coli. Kết quả cho thấy hoạt tính sinh học của phức chất mạnh hơn của ion kim loại tự do và các phối tử tương ứng. Khả năng kháng sinh của Cd – 5- BSAT mạnh hơn Ni – 5-BSAT đối với cả 2 loại vi khuẩn trên.
2. Đề xuất
Do thời gian hạn hẹp nên đề tài không tránh khỏi những sai sót, có nhiều hạn chế như: số mẫu khảo sát còn ít, số lần lặp lại chưa nhiều. Song với nền tảng lý thuyết đã đặt ra, em hi vọng sẽ mở ra những hướng nghiên cứu sâu hơn như:
+ Tiếp tục đo phổ 13
C – NMR, MS, tia X để xác định cấu trúc của phức.
+ Tiếp tục khảo sát các điều kiện tối ưu để từ đó ứng dụng phức chất tạo thành trong phân tích ion Ni2+, Cd2+.
+ Tiếp tục thử hoạt tính sinh học của các phức trên với các vi khuẩn và nấm khác (Staphylococcus Aureus, Lactobacillus Fermentum, Pseudomonas Aeruginosa, Salmonella Enterica, Candida Albicans...) từ đó có ứng dụng trong y học.
+ Tiếp tục thăm dò hoạt tính sinh học các phức chất tổng hợp được để tìm kiếm các chất có khả năng ứng dụng làm thuốc, tìm hiểu cơ chế hoạt tính sinh học của các thisemicarbazone, đồng thời đóng góp dữ liệu thực nghiệm cho lĩnh vực nghiên cứu mối quan hệ cấu tạo – hoạt tính sinh của các hợp chất trên cơ sở thisemicarbazone.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Nguyễn Trọng Biểu – Từ Văn Mặc (2002), Thuốc thử hữu cơ, Nhà xuất bản KHKT, Hà Nội.
2. Nguyễn Tiến Công (2009), Một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm.
3. Nguyễn Văn Dũng, Phạm Văn Ty, Dương Đức Tiến (1977), Vi sinh vật học tập 1, Nhà xuất bản Đại học và Trung học Hà Nội.
4. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, Nhà xuất bản Giáo dục.
5. Nguyễn Thị Kim Hạnh (1999), Hóa nguyên tố – Phần kim loại, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm.
6. Trần Thu Hương, Nghiên cứu tổng hợp, cấu tạo của một số phức chất Pd(II) với dẫn xuất của thiosemicarbazone, Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
7. Chu Đình Kính, Phan Thị Hồng Tuyết (2008), Phân tích phổ khối lượng của một số phức chất Ni (II) với thiosemicarbazone, Tạp chí Hóa học, T.46 (3), Tr.320 – 325.
8. Lê Chí Kiên, Từ Ngọc Ánh, Hóa học phức chất, Nhà xuất bản Giáo dục. 9. Hoàng Nhâm (2000), Hóa học vô cơ (tập 3), Nhà xuất bản Giáo dục.
10. Nguyễn Kim Phi Phụng (2005), Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Trần Quỳnh Phương (2011), Định lượng đồng thời Ni2+ và Zn2+ trong nước thải bằng phương pháp trắc quang kết hợp thuật toán thêm chuẩn điểm H, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
12. Nguyễn Đào Mỹ Trinh (2010), Định lượng đồng thời Pb (II) và Ni (II) trong nước thải bằng phương pháp trắc quang kết hợp thuật toán thêm chuẩn điểm H, Khóa luận tốt nghiệp, Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh.
13. TCVN 6193:1996, Chất lượng nước – Xác định coban, niken, đồng, kẽm, cadmi và chì – Phương pháp trắc phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa.
14. A. Diaz, R. Cao and A. Garcia (1994), Characterization and Biological Properties of a Copper(II) Complex with Pyruvic Acid Thiosemicarbazone, Monatshefte fiir Chemie, 125, 823 – 825.
15. Ah. Altuna, M. Kumrua, A. Dimoglo (2001), Study of electronic and structural features of thiosemicarbazoneand thiosemicarbazide derivatives demonstrating anti–HSV–1 activity, Journal of Molecular Structure (Theochem), 535, 235 –246.
16. Chu Dinh Kinh, Ha Phuong Thu, Duong Tuan Quang (2003), “Synthesis and structural investigations of some Platinum(II) complexes of mixed ligands including 3, 5 dimethylpyrazol and some thiosemicarbazones”,
Advances in Natural Sciences, Vol. 4, (No.1), P.55 – 62.
17. El Mostapha Jouad, Magali Allain, Mustayeen A. Khan, Gilles M. Bouet (2005), Structural and spectral studies of nickel(II), copper(II) and cadmium(II) complexes of 3–furaldehyde thiosemicarbazone, Polyhedron, 24, 327–332.
18. Fernanda Rosi Soares Pederzolli, Leandro Bresolin, Johannes Beck, Jorg Daniels and Adriano Bof de Oliveira (2012), [1–(5–Bromo–2– oxidobenzylidene)thio–semicarbazidato–3O, N1, S](pyridine–N)nickel(II), Acta Cryst, E68, m1138.
19. G. Ramanjaneyulu, P. Raveendra Reddy, V. Krishna Reddy and T. Sreenivasulu Reddy (2008), Direct and Derivative Spectrophotometric
Determination of Copper(II) with 5 – Bromosalicylaldehyde
Thiosemicarbazone, The Open Analytical Chemistry Journal,2, 78 – 82. 20. Hassan Ali Zamani (2008), Construction of Strontium PVC – Membrane
Sensor Based on Salicylaldehyde Thiosemicarbazone, Analytical Letters, 41, 1850 – 1866.
21. Huseyin Bag, A. Rehber Turker, Ramazan Coskun, Mehmet Sacak, Mustafa Yigitoglu (2000), Determination of zinc, cadium, cobalt and nickel by flame atomic absorption spectrometry after preconcentration by polyethylene terephthalate/ fibers grafted with methacrylic acid, Spectrochimica Acta Part B 55.
22. J.S. Casas, M.S. Garcia – Tasende, J. Sordo (2000), Main group metal complexes of semicarbazones and thiosemicarbazones. A structural review, Coordination Chemistry Reviews, 209, 197 – 261.
23. Jisha Joseph, N. L. Mary and Raja Sidambaram (2010), Synthesis, Characterization, and Antibacterial Activity of the Schiff Bases Derived from Thiosemicarbazide, Salicylaldehyde, 5 – bromosalicylaldehyde and their Copper(II) and Nickel(II) Complexes, Synthesis and Reactivity in Inorganic, Metal – Organic, and Nano – Metal Chemistry, 40:930 – 933. 24. Ju. Lurie (1975), Handbook of alnalytical chemmistry, Mir, Moscow,
English translation.
25. Keihei Ueno, Dr.Eng, Tohiaki Imamura, K.L.Cheng, Ph.D. (2002),
Handbook of Organic Analytical Reagents, CRC Press.
26. Masayuki Niheia, Takuya Shiga, Yonezo Maeda, Hiroki Oshio (2007), Spin crossover iron(III) complexes, Coordination Chemistry Reviews, 251, 2606 – 2621.
27. Michel J–M. Campbell (1975), Transition metal complexes of thiosemicarbazide and thiosemicarbazone, Coordination Chemistry Reviews, 15, 27 – 319.
28. N.B.Patel (2011), Synthesis, characterization and applications of 5–bromo salicylaldehyde and 5–bromo, 4–hydroxy, 3–methoxy benzaldehyde semicarbazone and thiosemicarbazone metal complexes, Asian Journal of Chemical and Environmental Research, Vol. 4 (1), 92 – 94.
29. Pradyot Patnaik, Ph.D. (2002), Handbook of Inorganic Chemicals, The McGraw – Hill Companies, Inc., the United States of America.
30. S. Laly and Geetha Parameswaran (1989), Gravimetric Determination of Nickel with Salicylaldehyde Thiosemicarbazone, The Chemical Society of Japan, Bull. Chem. Soc. Jpn., 62, 3763 – 3765.
31. Shigeroku Yamacuchi and Katsuya Uesuci (1986), Extraction–
Spectrophotometric Determination of Copper(II) with 5–
Nitrosalicylaldehyde–4–phenyl–3–thiosemicarbazone, Analystical
32. Sukriye Guveli, Namik Ozdemir, Tulay Bal–Demirci, Bahri Ulkuseven (2009), Nickel(II) complexes of ONS and ONN chelating thiosemicarbazones with triphenylphosphine co–ligands, Transition Met Chem, 34, 383 – 388.
33. Sukriye Guvel, Namik Ozdemir, Tulay Bal–Demirci, Bahri Ulkuseven, Muharrem Dincer, Omer Andac (2010), Quantum–chemical, spectroscopic and X–ray diffraction studies on nickel complex of 2–hydroxyacetophenone thiosemicarbazone with triphenylphospine, Polyhedron, 29, 2393 – 2403. 34. Tarlok S. Lobana, Rekha Sharma, Gagandeep Bawa, Sonia Khanna (2009),
Bonding and structure trends of thiosemicarbazone derivatives of metals – An overview, Coordination Chemistry Reviews, 253, 977 – 1055.
35. http://vi.wikipedia.org/wiki/Cadmi
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Phổ FT – IR của thuốc thử 5 – BSAT