2. Mục đích nghiên cứu
1.1.9. Một số nghiên cứu về vacxin PRRS trong và ngoài nước
Tại Việt Nam : Cho đến nay dịch bệnh tai xanh đã xuất hiện được nhiều
năm nhưng các công trình nghiên cứu về virus đặc biệt là các đặc tính sinh học và sinh học phân tử còn rất hạn chế. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội được Bộ giáo dục và đào tạo phê duyệt đề tài nghiên cứu công nghệ chế tạo Kít chẩn đoán PRRS đã tạo điều kiện cho việc nghiên cứu sâu hơn về virus PRRS và các đặc tính của virus tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu tiếp theo về vacxin phòng bệnh. Theo Chi cục Thú y Thành phố Hồ Chí Mình đưa tin: những chủng virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản trên lợn độc lực cao ở các vùng của Trung Quốc được phát hiện là không có quan hệ gì tới chủng virus vacxin ở Lan Châu (Trung Quốc), điều này có thể giải thích cho việc kém hiệu quả trong việc phòng bệnh của một vài vacxin. Xiaofang Hao và cộng sự ở Viện nghiên cứu Thú y Lan Châu của Học viện Khoa học Nông Nghiệp Trung Quốc đã nêu đặc điểm gien ORF7 của virus PRRS ở Trung Quốc trong một bài báo đăng trên tạp chí Virology. Tác giả của bài báo giải thích rằng, virus PRRS thể hiện sự biến đổi gien rộng rãi. Việc bùng phát dịch bệnh PRRS độc lực cao vào năm 2006 đã khiến cho họ phải nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của virus PRRS tại Trung Quốc. Để đạt được điều này, họ đã phân tích trình tự các gien Nsp2 và ORF7 của 98 chủng virus PRRS Trung Quốc phân lập. Phân tích sơ bộ cho thấy những chủng virus PRRS độc lực cao có một acid amin ở vị trí 30 bị xóa mất
trong chuỗi protein không cấu trúc (Nsp2) là những chủng virus chủ yếu đang lưu hành tại Trung Quốc. Phân tích sâu hơn dựa trên trình tự gien ORF7 cho thấy tất cả các chủng phân lập ở Trung Quốc được chia thành 5 nhóm phụ, và các chủng virus PRRS độc lực cao không có liên quan đến vacxin MLV hay CH-1R, điều này làm tăng nghi ngờ về hiệu quả của các loại vacxin này. Các dữ liệu về trình tự các gien của ORF7 cũng thể hiện không có sự liên kết rõ ràng giữa nguồn gốc địa lý hay thời gian và tính không đồng nhất của virus PRRS ở Trung Quốc. Những phát hiện này nâng cao kiến thức của chúng ta về các đặc tính di truyền của các chủng virus PRRS Trung Quốc phân lập đồng thời cho phép chúng ta nghĩ đến các trường hợp PRRSV phân lập Việt Nam, chúng ta cần có một nghiên cứu về sản xuất vacxin từ chính các chủng PRRSV Việt Nam để mang lại hiệu quả phòng bệnh tốt nhất.
Những nghiên cứu về PRRS tại Việt Nam đều tập trung về vai trò kết hợp của các mầm bệnh kế phát và tạo nên bệnh hô hấp phức hợp ở lợn như nghiên cứu của Phòng vi trùng, Viện thú y quốc gia về một số vi khuẩn thường gặp khi lợn bị bệnh tai xanh hoặc tập trung vào nghiên cứu tình hình dịch tễ của PRRS tại Việt Nam. Theo báo cáo kết quả hội thảo khoa học phòng chống hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn của Cục thú y năm 2008 thì hiện tại ở Việt Nam tồn tại cả hai chủng virus PRRS thuộc dòng Bắc Mỹ: chủng cổ điển độc lực thấp và chủng biến thể độc lực cao. Trong đó, chủng virus PRRS độc lực cao gây bệnh tại Việt Nam thuộc dòng Bắc Mỹ và tương đồng với chủng PRRSV độc lực cao gây bệnh tại Trung Quốc. Các mầm bệnh kế phát trong ổ dịch PRRS gồm có: virus PCV2, virus Dịch tả lợn và các vi khuẩn: Pasteurella spp,Mycoplasma spp, Streptococcus, Salmonella, Heamorphylus, E.coli, Actinobacillus pleuropneumoniae...
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào về sản xuất vacxin chống PRRSV tại Việt Nam. Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn đã cấp phép nhập khẩu và cho sử dụng 4 loại vacxin chống PRRS trong nước bao gồm BSL-PS100 do
Singapore sản xuất, Amervac-PRRS của Tây Ban Nha, Bodige do Đức sản xuất và một loại vacxin sống có xuất xứ từ Trung Quốc (sau khi kết quả giải trình tự PRRSV từ vụ dịch năm 2010 cho thấy có sự tương đồng với một virus phân lập ở Trung Quốc năm 2009 (Ikesi, 2011)). Như vậy các nghiên cứu về vacxin phòng PRRS ở Việt Nam đều là các nghiên cứu khảo nghiệm những vacxin nhập khẩu.
Nước ngoài : Ở Trung Quốc, các ổ dịch đầu tiên của dịch tai xanh đã
được ghi lại vào năm 1995 ở hầu hết tất cả các tỉnh (bao gồm cả Hồng Kông). Do tác động lớn tới nền kinh tế ở Trung Quốc, bệnh đã được công nhận là một trong những bệnh virus nghiêm trọng nhất cho các trang trại nuôi lợn. Dòng PRRSV Trung Quốc đầu tiên được phân lập vào năm 1996, và trình tự bộ gien hoàn chỉnh của PRRSV Trung Quốc cô lập BJ-4 lần đầu tiên được báo cáo vào năm 2001 . PRRSV chủng độc lực cao là tác nhân gây sốt cao và tỷ lệ tử vong cao ở lợn mọi lứa tuổi. Kể từ tháng 5 năm 2006, các chủng PRRSV độc lực cao đã xuất hiện ở Trung Quốc. Gần đây, đặc điểm di truyền của các chủng PRRSV phân lập được ở Trung Quốc khác với PRRSV phân lập ở Bắc Mỹ và châu Âu . Người ta đã ghi nhận rằng các chủng PRRSV này khác nhau về độc lực và có sự thay đổi di truyền . Điều này dẫn đến hệ quả là các chủng virus dùng để chế tạo vacxin hoặc kháng nguyên chiết tách từ virus có thể không phòng bệnh được cho đàn lợn.
Người ta đã chứng minh rằng có sự biến dị di truyền mạnh trong cả 2 typ loại I và loại II phân lập được khẳng định qua phân tích trình tự nucleotide và amino axit của VR-2332 so với LV là 76%( ORF-2); 72%( ORF-3 ); 80%(ORF- 4 và 5); 91% (ORF-6); 74% (ORF-7); phân tích trình tự cho thấy các virus đang tiến hóa đột biến ngẫu nhiên và tái tổ hợp trong gien (Murtaugh và cs, 1995; Nelsen và cs,1999; Meng và cs, 1995; Kapur và cs, 1996).
Các chủng virus PRRS gây bệnh cho động vật cảm thụ với biểu hiện bệnh lý giống nhau nhưng tính tương đồng về cấu trúc nucleotide của dòng I và II sai
khác khoảng 60%. Các chủng virus phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau có sự khác nhau về tính di truyền. Bản thân virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khá cao đến 20%, đặc biệt là các chủng thuộc dòng Bắc Mỹ. Chủng bắc Mỹ có 3 subtyp lớn là: VR-2332, Taiwan và 807/94 phân lập ở Canada. Chủng châu Âu có 2 subtyp lớn là: I10 phân lập tại Hà Lan và Olot phân lập tại Tây Ban Nha. Chính sự khác biệt về tính di truyền và sự đa dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng thêm những khó khăn trong việc sản xuất vacxin chống lại nó. Một điều đáng lưu ý nữa là ở một số quốc gia còn lưu hành cả hai dòng virus Bắc Mỹ và Châu Âu.
Nghiên cứu các đặc tính sinh học của các chủng PRRSV đã được tiến hành từ khi bệnh bắt đầu xuất hiện trên thế giới nhưng cho đến nay nó vẫn được quan tâm nghiên cứu do virus luôn luôn biến đổi về cấu trúc di truyền để tăng khả năng gây bệnh. Từ 2 chủng nguyên gốc ban đầu trải qua hai mươi năm tồn tại và phát triển nó đã tạo ra vô số biến chủng khác nhau theo các vùng địa lý khác nhau. Chengmin Wang và cộng sự (2010) đã so sánh đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các chủng PRRSV phân lập được ở Trung Quốc với chủng gốc (có độc lực cao) được sử dụng để làm vacxin sống nhược độc (Modifier life vacine-MLV) và chủng ATCC-VR2385 được biết đến có độc lực cao bằng cách gây bệnh cho các nhóm lợn khác nhau. Các phân tích sinh học phân tử và đặc tính sinh học cho thấy PRRSV 98-38803 phân lập ở Trung Quốc (99,5% amino acid tương đồng dựa trên gien ORF5) gây ra các tổn thương viêm phổi tương tự như các loại virus gốc, nhưng khác nhau ở mức độ nghiêm trọng và thời gian khởi phát bệnh. Chengmin Wang và cộng sự (2010) đã phân tích 5 gien (GP2, GP3, GP4, GP5 và NSP2) của 7 chủng PRRSV phân lập ở Trung Quốc, được chỉ định là: LS-4, HM-1, HQ-5, HQ-6, GC-2, GCH-3 và ST-7. Năm 2008, những chủng đã được lập trình tự và phân tích. Kết quả là phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự nucleotide của ORF2-5 và NSP2 cho thấy bảy chủng PRRSV
phân lập ở Trung Quốc thuộc các phân nhóm di truyền giống nhau và có liên quan đến các kiểu gien ở Bắc Mỹ PRRSV. Phân tích so sánh với các trình tự có liên quan của một chủng PRRSV khác đã phân lập ở Trung Quốc (BJ-4) và Bắc Mỹ (VR2332 và MLV) cho thấy rằng những virus phân lập có 80,8-92,9% tương đồng với VR-2332, và 81,3-98,8% với MLV và 80,7- 92,9% với BJ-4. Tuy nhiên, tất cả các chủng virus được nghiên cứu đều có 97% tính tương đồng với các chủng gây bệnh độc lực cao ở Trung Quốc. Ngoài ra, có sự đột biến lớn về amino acid (aa) trong protein GP5 và protein Nsp2 khi so sánh với các chủng phân lập trước đó trên thế giới.
Cha SH và cộng sự (2009) đã nghiên cứu hai mươi tám chủng virus PRRSs (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome strain) được phân lập từ các trang trại nuôi lợn khác nhau tại Hàn Quốc từ năm 2002 và 2003, đã giải trình tự cho khung đọc mở ORF5 và độ dài hệ gien đầy đủ, so sánh với PRRSVs trong nhiều báo cáo từ Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á. Tất cả các chủng virus phân lập ở Hàn Quốc được kiểm tra có kiểu gien di truyền giống với dòng virus của Bắc Mỹ. Đặc biệt, trình tự ORF5 của một chủng phân lập được giống với chủng virus PRRS Ingelvac MLV. Trình tự nucleotide ORF5 của 27 PRRSVs còn lại của Hàn Quốc giống với chủng VR-2332. Phân tích phát sinh loài của ORF5 và độ dài đầy đủ về trình tự gien cho thấy PRRSVs phân lập ở Hàn Quốc đã thành lập một nhánh riêng biệt so với các PRRSVs được báo cáo từ các nước châu Á khác (Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và Thái Lan). Nghiên cứu đã chứng minh rằng PRRSVs của kiểu gien ở Bắc Mỹ đã xâm nhiễm vào lợn của Hàn Quốc một thời gian trước và đã phát triển thành một nhánh độc lập so với các PRRSVs ở các nước châu Á khác, như vậy việc tách biệt về địa lý có thể ảnh hưởng đến sự tiến hóa phân tử của PRRSV. Điều này phải được xem xét khi một quốc gia phòng chống dịch tai xanh và cần thiết lập chính sách kiểm soát đối với thương mại quốc tế.
Tại |Thái Lan đã nghiên cứu các chuỗi nucleotide hoàn chỉnh trong hai chủng PRRSV phân lập được là 01CB1 và 01NP1 về kiểu gien đã xác định: 01CB1 và 01NP1 chứa 14.943 và 15.412 nucleotide, tương ứng. Phân tích phát sinh loài của virus cũng cho thấy 01CB1 và 01NP1 được nhóm lại thành 2 nhóm kiểu gien tương ứng là châu Âu và Bắc Mỹ. Để xác định các biến thể di truyền và quan hệ di truyền giữa các chủng PRRSV phân lập ở Thái Lan, 01CB1 và 01NP1 được so sánh với 2 chủng của EU (Lelystad, và EuroPRRSV), 6 chủng Bắc Mỹ (MLV, VR2332, PA8, 16244B, SP và HUN4). Kết quả cho thấy hệ gien của chủng 01CB1 tương đồng khoảng 99,2% nucleotide với Lelystad và 95,2% với EuroPRRSV. Trong khi, bộ gien 01NP tương đồng 99,9% nucleotide với một chủng virus vaccine sống (MLV) và 99,5% và 98,5% nucleotide với 2 chủng virus khác của Bắc Mỹ là VR2332 và 16244B. Ngoài ra, trình tự nucleotide ORF5 của 9 chủng virus PRRS phục hồi ở Thái Lan trong thời gian 2002-2008 cũng đã được giải trình tự trong nghiên cứu này. Phân tích phát sinh loài thông qua ORF5 cho thấy có sự giống nhau đáng kể về kiểu gien của 01CB1 và 01NP với các chủng virus đã so sánh. Như vậy 01CB1 có thể tiến hóa từ các mẫu thử nghiệm EU, virus Lelystad, trong khi 01NP1 có thể có nguồn gốc và tiến hóa từ virus vacxin sống hoặc các subtyp có quan hệ gần gũi với nó.
Tun HM và cộng sự, 2011 đã thu thập tất cả các trình tự PRRSV ở Thái Lan được mô tả trước đó và kết hợp chúng vào sự đa dạng toàn cầu. Kết quả cho thấy PRRSVs ở Thái Lan được bắt nguồn từ nhiều chủng PRRSV khác nhau trong đó tồn tại cả hai loại: loại I và loại II. Như vậy sự đa dang di truyền của các chủng PRRSV ở các quốc gia khác nhau là khác nhau rất nhiều.
So sánh trình tự phân tích 2 chủng EU và chủng Bắc Mỹ cổ điển là chủng LelytasVivus (LV) và VR-2332 cho thấy mức tương đồng tương ứng là 87,0- 91,5% và 58,0-58,2. Đặc biệt các phân lập cũng cho thấy đặc trưng bị xóa các nucleotide đồng thời trên các protein không cấu trúc (Nsp2) và khung đọc mở số 3 (ORF3). Kết quả từ cây phát sinh loài còn cho thấy rằng tất cả các chủng phân
lập chiếm đa số là chủng châu Âu cổ điển, tuy nhiên chúng lại tiến hóa từ nguồn gốc khác nhau. Những virus mới được dự báo là các sản phẩm của sự tiến hóa khác nhau của tổ tiên PRRSV phân lập được báo cáo từ châu Âu. Đây là báo cáo đầu tiên của PRRSV chủng Châu Âu thực địa được phân lập tại Trung Quốc. Kết quả phát hiện của nghiên cứu này đã xác nhận rằng các chủng EU Trung Quốc có cùng nguồn gốc với các chủng cổ điển nhưng có đặc tính sinh học khác nhau đã cùng tồn tại ở Trung Quốc đại lục trong nhiều năm qua. (Nguồn: Emergience of novel European gienotype PRRSV in mainland China).
Những nghiên cứu chuyên sâu về cấu trúc virus PRRS và đáp ứng miễn dịch của cơ thể lợn mắc PRRS đã có những thành tựu đáng kể: cấu trúc protein của virus, trình tự hệ gien hay thậm chí các epitop trên bề mặt virus cũng đã được xác định. Các nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu và sản xuất các loại vacxin nhằm kiểm soát và phòng chống bệnh. Một số vacxin hiện đang được sử dụng rộng rãi trên thế giới bao gồm các vacxin vô hoạt như Progressis, Suvaxyn PRRS, Ingelvac PRRS KV, Suipravac PRRS hay các vacxin sống nhược độc như Amervac PRRS, Pyrsvac 183, Porcilis PRRS, Ingelvac PRRS MLV. Tuy nhiên, hiện tại những vacxin này vẫn không đáp ứng được yêu cầu về kiểm soát và phòng chống PRRS trên thế giới. Nhiều hướng nghiên cứu phát triển vacxin cũng được đề cập tới; Prieto và cộng sự, 2010 đã nghiên cứu sản xuất vacxin dưới đơn vị GP5 (một loại epitop của PRRSV) hay nghiên cứu tổ hợp GP5 vào tế bào thực vật (Chia và cs, 2010). Ngoài ra những nghiên cứu xung quanh việc cải tiến quy trình chế tạo vacxin cũng đã triển khai như nghiên cứu của William và cộng sự (2003) về so sánh hiệu quả của vacxin đơn chủng và vacxin đa chủng PRRS hay nghiên cứu của S.Deville và cộng sự (2011) về việc bổ sung 50% tá dược vào vacxin thay vì sử dụng vacxin với 100% thành phần là kháng nguyên. Mặc dù vậy, PRRS vẫn chưa được khống chế và ngành thú y các nước vẫn chưa có được vacxin chuẩn quốc tế để phòng chống PRRS cho đất nước mình. Tại hội thảo chuyên đề về triển vọng cải thiện hiệu quả của
vacxin chống PRRS được tổ chức tại Mỹ năm 2007, các nhà khoa học đều thống nhất quan điểm rằng sẽ phải mất khoảng 5-10 năm nữa để có thể có quy trình chế tạo vacxin tiêu chuẩn trên thế giới. Như vậy, tính đến hiện tại, các nước vẫn phải tự áp dụng mọi biện pháp để kiểm soát PRRS cho đàn lợn của nước mình mà không thể trông chờ vào vacxin được sản xuất từ các nước khác.