2. Mục đích nghiên cứu
2.7. Tiêu chí lựa chọn chủng để sản xuất vacxin vô hoạt phòng PRRS
Một chủng virus được lựa chọn để sản xuất vacxin thì cần phải thỏa mãn các tiêu chí sau :
Có tính tương đồng với kháng nguyên Virus phân lập được có tính độc lập Tính kháng nguyên ổn định
Độ tinh khiết cao
Hiệu giá virus khi nuôi cấy virus trên môi trường tế bào cao.
Trong các tiêu chí này thì tiêu chí tính kháng nguyên phải ổn định là quan trọng nhất vì nếu không ổn định khi ta cấy truyền đời thì virus có thể bị biến đổi, làm thay đổi cấu trúc cũng như chức năng của kháng nguyên, như vậy độ ổn định đã không có thì không thể đạt tiêu chuẩn để sản xuất vacxin.
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả thu thập mẫu và mổ khám bệnh tích
Chúng tôi tiến hành thu thập mẫu bệnh phẩm từ những lợn nghi mắc PRRS tại các trang trại ở một số tỉnh miền Bắc. Triệu chứng lâm sàng của lợn được theo dõi ngay từ những ngày đầu và được ghi chép đầy đủ để làm cơ sở cho việc thu thập mẫu. Thông tin mẫu được ghi lại trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả thu thập mẫu Ký
hiệu
Nhóm lợn
Số
lượng Triệu chứng Bệnh tích đại thể
L1 Lợn con
theo mẹ 15
Sốt, bỏ bú, yếu ớt, run rẩy,lết chân, có rử mắt, tiêu chảy
Phổi viêm, lách nhồi huyết, ruột loét, hạch lympho sung huyết
L2 Lợn sau
cai sữa 17 Sốt, bỏ ăn, phát ban
Phổi viêm màu đỏ xám, lách sưng to, tụ máu, cơ tim nhão
L3 choai Lợn 12
Sốt, khó thở, tím tai, sưng mí mắt, tiêu chảy
Phổi viêm nhục hóa, tím bầm, ruột loét, hạch lympho thoái hóa, hoại tử, thận xuất huyết L4 Lợn nái mang thai 4 Sốt, bỏ ăn, viêm phổi, sảy thai, tím tai
Phổi viêm, sảy thai, âm môn sưng tụ huyết, niêm mạc tử cung âm đạo loét, xuất huyết
L5 nuôi con Lợn nái 5
Sốt, bỏ ăn, viêm vú, tím đuôi, tím âm hộ, viêm da dị ứng đóng vảy, táo bón
Phổi viêm đỏ xám, hạch sưng to, niêm mạc tử cung loét, sưng dày lên và phủ dịch rỉ viêm
Tổng số 53
Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng của lợn nghi mắc PRRS chúng tôi thấy triệu chứng chủ yếu của lợn con là sốt, bỏ ăn, bỏ bú, mí mắt sưng, có thể táo bón hoặc tiêu chảy... Ở lợn choai có hiện tượng sốt, bỏ ăn nhẹ hơn lợn con nhưng những biểu hiện khác như khó thở, tím tai, sưng mí mắt lại nặng hơn. Trên đàn lợn nái thì triệu chứng chủ yếu là sốt bỏ ăn, sảy thai, lợn nái nuôi con còn có biểu hiện viêm vú…
Lợn ủ rũ, mệt mỏi Tai sung huyết
Sảy thai Viêm sưng mí mắt Hình 3.1. Một số hình ảnh triệu chứng lâm sàng trên lợn mắc PRRS
Nguồn :http://apc-health.vn/vn/download/10/benh-heo-tai-xanh-prrs-.html
Tiến hành mổ khám những lợn bệnh. Do điều kiện không cho phép có thể mổ khám tất cả trường hợp lợn mắc bệnh vì vậy chúng tôi đã chọn ra 30 lợn có triệu chứng lâm sàng điển hình, có hồ sơ tiểu sử rõ ràng, tiến hành mổ khám. Kết quả bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS được trình bày ở bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả nghiên cứu một số bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS
STT Biểu hiện lâm sang Số con
theo dõi
Số con
Biểu hiện Tỷ lệ (%)
1 Viêm màng phổi 30 22 68,7
2 Phổi xuất huyết 30 10 33,3
3 Phổi viêm hóa mủ 30 8 26,6
4 Phổi hoại tử 30 17 56,6
5 Phổi nhục hóa 30 15 50,0
6 Phù phổi 30 24 80,0
7 Phổi tụ máu 30 10 33,3
8 Hạch lâm ba phổi sưng 30 27 90,0
9 Lách thoái hóa 30 21 70,0
10 Hạch ruột sưng 30 25 83,3
11 Tim xung huyết, xuất huyết 30 7 23,3
12 Gan tổn thương, thoái hóa 30 13 43,3
13 Thận xuất huyết 30 10 33,3
14 Ruột non xuất huyết 30 12 40,0
15 Ruột già xuất huyết 30 6 20,0
16 Tử cung viêm, xuất huyết 30 7 23,3
17 Não viêm, xuất huyết 30 10 33,3
Qua quá trình mổ khám, quan sát những biến đổi trên các cơ quan, tổ chức của lợn bệnh. Chúng tôi xác định một số bệnh tích chủ yếu của lợn mắc bệnh tai xanh như sau:
Bệnh tích tập trung chủ yếu ở phổi. Tất cả các trường hợp mổ khám đều có bệnh tích ở phổi. Phổi viêm ở các mức độ khác nhau tùy thuộc vào từng nhóm lợn và mức độ tiến triển của bệnh. Phổi viêm và phù làm cho các thùy phổi cứng lại,
mặt cắt hơi lồi, thả miếng phổi nhỏ vào bát nước thấy miếng phổi chìm, bệnh tích này thường gặp ở những ca mổ khám. Mức độ viêm lan tràn ở tất cả các thùy phổi và phổi viêm đỏ xám có các đám hoại tử là bệnh tích điển hình và thường gặp ở các nhóm lợn. Kết quả này của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007).
Trong quá trình mổ khám chúng tôi còn quan sát được trường hợp lợn bệnh viêm phổi viêm dính với lồng ngực, màng phổi phủ một lớp fibrin màu vàng, xoang ngực tích nước. Phổi lợn bệnh bị thủy thũng, sưng to làm cho bề mặt phổi căng lên bong loáng, viêm kẽ phổi điển hình (Paton và cs, 1991).
Lợn mắc PRRS dễ thấy các hạch lâm ba sưng tụ máu, tụ máu nhiều nhất ở hạch lâm ba vùng phổi. Thận xuất huyết điểm là bệnh tích hay gặp nhất là lợn con sau cai sữa và lợn choai, tần suất xuất hiện bệnh tích này ở lợn nái ít hơn.
Tử cung viêm, xuất huyết là biến đổi đại thể thường thấy ở lợn nái. Hiện tượng viêm rải rác trên bề mặt tử cung với biểu hiện là các điểm chấm đỏ, đôi khi chúng lan tràn thành từng dải. Niêm mạc tử cung sưng dày lên và phủ một lớp dịch rỉ viêm màu hồng nhạt.
Hiện tượng thoái hóa cơ tim là biểu hiện hay gặp ở các trường hợp mổ khám ở lợn sau cai sữa và lợn choai. Cơ tim của lợn mắc PRRS thường nhạt màu, nhão, mất đi đọ rắn chắc. Điều này giải thích có thể do quá trình viêm ở phổi làm cho lợn khó thở và để đáp ứng nhu cầu oxi cho hô hấp thì tim phải tăng cường hô hấp hoạt động bù và khi hoạt động quá mức thì cơ tim bị thoái hóa là điều rõ ràng. Lách nhồi huyết cũng là biểu hiện có thể quan sát được, tuy nhiên hiện tượng nhồi huyết không đặc trưng cho lợn mắc PRRS.
Phổi viêm Hạch lympho sưng to
Thận xuất huyết Lách nhồi huyết Hình 3. 2. Một số hình ảnh bệnh tích đại thể lợn mắc PRRS 3.2. Kết quả RT- PCR chẩn đoán PRRS
Với tổng số mẫu huyết thanh và bệnh phẩm thu thập được ( gồm hạch, lách, phổi) , chúng tôi tiến hành tách chiết RNA của virus để thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi ORF5-F và ORF5-R (603bp) để xác định chính xác sự có mặt của virus PRRS. Kết quả chẩn đoán PRRS được trình bày trong bảng 3.3
Bảng 3.3. Kết quả RT-PCR chẩn đoán PRRS từ mẫu bệnh phẩm
Ký
hiệu Nhóm lợn Số lượng
Kết quả RT-PCR
Số mẫu dương tính Tỷ lệ ( %)
L1 Lợn con theo mẹ 15 7 46,67
L2 Lợn sau cai sữa 17 8 47,05
L3 Lợn choai 12 4 33,33
L4 Lợn nái mang thai 4 1 25,00
L5 Lợn nái nuôi con 5 1 20,00
Tổng 53 21 39,62
Dựa vào bảng 3.3 ta thấy trong tổng số 53 mẫu thu thập được từ các nhóm lợn nghi ngờ mắc PRRS ở các địa phương, ta phát hiện được 21 mẫu dương tính chiếm 39,62%. Trong đó tỷ lệ nhiễm ở các độ tuổi là khác nhau. Ở nhóm lợn con theo mẹ và nhóm lợn sau cai sữa tỷ lệ mắc bệnh PRRS là cao nhất chiếm 46,67% và 47,05%. Giải thích cho điều này có thể là do lợn con theo mẹ cơ thể vẫn còn non, chưa hoàn thiện về các cơ quan bộ phận cũng như hệ thống miễn dịch. Trong khi đó, lợn sau cai sữa tuy tỷ lệ mắc cao hơn một ít 47,05% . Có thể do ở giai đoạn này, lợn con không còn nhận được kháng thể đặc hiệu từ mẹ truyền cho, sức đề kháng còn kém do mới tách đàn sống trong môi trường mới nên khả năng bị virus tấn công cao. Ở nhóm lợn nái tỷ lệ mắc bệnh cũng không cao chỉ từ 20-25%. Nhóm lợn nái nuôi con có tỷ lệ mắc bệnh thấp nhất trong các nhóm lợn nghiên cứu, chỉ chiếm 20,0%. Trên thực tế thu thập mẫu từ lợn có triệu chứng điển hình của bệnh nhưng khi kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR thì chỉ có 21 mẫu cho kết quả dương tính trên băng điện di. Nguyên nhân có thể là do chúng tôi tiến hành lấy mẫu vào cuối ổ dịch hoặc do quá trình bảo quản và vận chuyển mẫu chưa được tốt cho nên kết quả tin cậy chỉ còn lai 21 mẫu.
Hình 3.3. Kết quả RT-PCR với cặp mồi ORF5F-ORF5R (603bp) chẩn đoán mẫu bệnh phẩm
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 5
500bp 750bp
Giếng 1: ĐC (-), Giếng 2: DNA Marker (1 kb Plus DNA Ladder, Invitrogen), Giếng 3: ĐC (+), Giếng 4 - 15: mẫu dương tính, Giếng 16: mẫu âm tính
Việc sử dụng phản ứng RT-PCR giúp cho chúng tôi khẳng định chắc chắn các mẫu thu thập ở thực địa là các mẫu có virus PRRS. Điều này thực sự rất quan trọng cho bước tiếp theo của đề tài là phân lập virus từ thực địa làm cơ sở cho việc sản xuất vacxin phòng bệnh sau này.
3.3. Kết quả phân lập virus PRRS
Sau khi xác định được 21 mẫu bệnh phẩm dương tính bằng kỹ thuật RT- PCR, do giới hạn về thời gian và hóa chất, chúng tôi lựa chọn ngẫu nhiên 13 mẫu dương tính (5 mẫu huyết thanh, 3 mẫu phổi, 5 mẫu hạch phổi) để tiến hành phân lập virus PRRS trên môi trường tế bào MARC-145. Với mục đích khẳng định lại một lần nữa kết quả của phản ứng RT - PCR. Đồng thời chúng tôi cũng mong muốn thu được một lượng virus đủ lớn để tách chiết RNA của virus phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.1. Kết quả gây nhiễm virus PRRS phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 lần 1 145 lần 1
Với 13 mẫu (gồm 5 mẫu huyết thanh, 3 mẫu phổi, 5 mẫu hạch phổi) đã xác định dương tính với virus PRRS, chúng tôi xử lý và phân lập virus PRRS trên tế bào MARC-145. Sau khi gây nhiễm mẫu bệnh phẩm vào tế bào Marc- 145 để khay nuôi cấy trong tủ ấm 370C và có 5% CO2. Quan sát CPE tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72 và 84 giờ bằng kính hiển vi soi ngược. Chúng tôi đánh giá khả năng gây bệnh tích trên tế bào của virus PRRS theo mức độ phần trăm CPE. CPE đạt 100% khi bệnh tích tế bào của virus PRRS xuất hiện trên cả mặt bình/giếng nuôi cấy. CPE đạt 0% khi chưa thấy có bệnh tích tế bào. So sánh bệnh tích trên môi trường tế bào đã gây nhiễm với các mẫu đối chứng dương (dùng chủng virus vaccine JAX1 của Trung Quốc làm đối chứng), đối chứng âm bằng việc đánh giá tế bào chết sau gây nhiễm. Kết quả gây nhiễm lần 1 được ghi nhận tại bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả gây nhiễm virus PRRS phân lập được trên môi trường tế bào MARC-145 lần 1
Nhóm
lợn Loại mẫu
Tỷ lệ tế bào bị phá hủy (%) Kết quả
CPE 24h 48h 72h 96h 120h 1 Huyết thanh 1 0 0 0 0 0 - 1 Huyết thanh 2 0 30 65 80 85 + 1 Hạch phổi 1 0 0 0 0 0 - 2 Huyết thanh3 0 0 0 0 0 - 2 Phổi 1 0 20 40 60 80 + 2 Hạch phổi 2 0 0 5 10 20 + 3 Huyết thanh 4 0 20 60 75 85 + 3 Hạch phổi 3 0 0 5 10 20 + 3 Hạch phổi 4 0 0 0 0 0 - 4 Huyết thanh 5 0 0 0 0 0 - 4 Phổi 2 0 0 5 10 20 + 5 Phổi 3 0 0 0 0 0 - 5 Hạch phổi 5 0 0 0 0 0 - Chú thích: (+): có bệnh tích , (±): bệnh tích nghi ngờ, (-): không có bệnh tích
Chúng tôi nhận thấy, sau khi gây nhiễm 48h, 1 mẫu huyết thanh (của nhóm lợn con theo mẹ), 1 mẫu huyết thanh (của nhóm lợn choai), 1 mẫu phổi (của nhóm lợn con sau cai sữa) trong số 13 mẫu đã có biểu hiện bệnh tích tế bào. Bệnh tích chủ yếu là tế bào co tròn, chết và bong lên khỏi bề mặt nuôi cấy. Tỷ lệ tế bào chết tăng dần đến 120h là 85%. Trong khi đó, 2 mẫu hạch phổi (của nhóm lợn con sau cai sữa và lợn choai) cùng với 1 mẫu phổi (của nhóm lợn nái mang thai) được chúng tôi xếp vào nhóm mẫu có biểu hiện bệnh tích nghi ngờ sau lần gây nhiễm đầu tiên do tỷ lệ tế bào chết thấp chỉ 20% và thời gian xuất hiện bệnh tích lâu (sau 72h nuôi cấy). Còn lại các mẫu khác đều có kết quả giống đối chứng âm.
Như vậy, trong tổng số 13 mẫu gây nhiễm lần 1, có 2 huyết thanh và 1 mẫu phổi có biểu hiện bệnh tích tế bào, 2 mẫu hạch phổi và 1 mẫu phổi có biểu hiện bệnh tích ở dạng nghi ngờ, còn lại đều giống đối chứng âm.
Khi phân lập virus trên môi trường tế bào, virus có thể gây bệnh tích tế bào chậm hoặc không gây bệnh tích ở lần gây nhiễm đầu tiên, nhưng ở lần gây nhiễm tiếp theo có thể xuất hiện bệnh tích. Do đó, chúng tôi thu hoạch dịch tế bào và gây nhiễm lần 2 trên môi trường tế bào MARC-145.
3.3.2. Kết quả gây nhiễm virus PRRS phân lập được trên môi trường tế bào MARC-145 lần 2 MARC-145 lần 2
Chúng tôi tiến hành thu dịch tế bào của 13 mẫu để gây nhiễm lần 2 trên môi trường tế bào MARC-145. Kết quả được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3.5. Kết quả gây nhiễm virus PRRS phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 lần 2. Nhóm lợn Loại mẫu Tỷ lệ tế bào bị phá hủy (%) Kết quả CPE 24h 36h 48h 72h 96h 120h 1 DTBHT 1 0 0 0 0 0 0 - 1 DTBHT 2 0 20 30 50 80 90 + 1 DTBHP 1 0 0 0 0 0 0 - 2 DTBHT 3 0 0 0 0 0 0 - 2 DTBP 1 0 20 30 45 70 90 + 2 DTBHP 2 0 0 30 45 85 100 + 3 DTBHT 4 0 20 45 60 85 100 + 3 DTBHP 3 0 0 20 45 60 85 + 3 DTBHP 4 0 0 0 0 0 0 - 4 DTBHT 5 0 0 0 0 0 0 - 4 DTBP 2 0 0 30 45 60 95 + 5 DTBP3 0 0 0 0 0 0 - 5 DTBHP 5 0 0 0 0 0 0 -
Chú thích: HP: hạch phổi, HT: huyết thanh, P: phổi, DTB: dịch tế bào (+): có bệnh tích , (-): không có bệnh tích
Qua bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy những mẫu nghi ngờ lần gây nhiễm 1 sau khi gây nhiễm lần 2 có biểu hiện bệnh tích tế bào sớm hơn (48h sau gây nhiễm) và phá hủy 85% tế bào sau 120h. Do vậy, có thể xếp mẫu này vào nhóm có biểu hiện bệnh tích. Đối với 2 mẫu huyết thanh và 1 mẫu phổi đã có bệnh tích ở lần gây nhiễm 1, chúng tôi quan sát thấy thời gian biểu hiện bệnh tích sớm hơn (36h sau gây nhiễm) và tỷ lệ phá hủy cũng cao hơn (90-100% sau 120h gây nhiễm). Có thể kết luận, virus đã thích ứng tốt hơn trên môi trường tế bào MARC-145 sau 2 lần gây nhiễm.
Như vậy, sau 2 lần gây nhiễm trên môi trường tế bào MARC-145, trong số 13 mẫu có 6 mẫu biểu hiện bệnh tích tế bào (2 mẫu hạch phổi và 2 mẫu huyết thanh và 2 mẫu phổi), chiếm 46,0%. Những mẫu còn lại không gây bệnh tích tế bào có thể do virus đã chết trong quá trình bảo quản và vận chuyển.
3.3.3. Kết quả gây nhiễm virus PRRS phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 lần 3. 145 lần 3.
Để kiểm tra tính thích ứng của virus PRRS, chúng tôi tiếp tục gây nhiễm dịch nuôi cấy tế bào của 2 mẫu đã phân lập được, và theo dõi tỷ lệ tế bào bị phá hủy tại các thời điểm.
Bảng 3.6. Kết quả gây nhiễm virus PRRS phân lập trên môi trường tế bào MARC-145 lần 3.
Nhóm
lợn Loại mẫu
Tỷ lệ tế bào bị phá hủy (%) Tên virus
phân lập 24h 36h 48h 60h 72h 84h 1 DTBHT2 0 30 55 75 95 100 HUA/HP1963 2 DTBP 1 0 20 30 60 85 100 HUA/HP2228 2 DTBHP 2 0 20 30 50 90 100 HUA/HP1 3 DTBHT 4 0 20 45 60 85 100 HUA/HP2 3 DTBHP 3 0 20 40 55 85 100 HUA/HP3