2. Mục đích nghiên cứu
2.6.7. Phương pháp xác định hiệu giá virus trên môi trường tế bào
TCID50 (50% The Tissue Culture Infectious Dose) là phương pháp xác định hiệu giá virus dựa trên điểm tới hạn (end point) cho biết liều virus tại đó gây hủy hoại 50% số giếng tế bào (Karber Formula). Ví dụ: khi nói nồng độ virus trong thí nghiệm TCID50 là 103 TCID50/ml ghi nhận sau 4 ngày theo dõi thí nghiệm có nghĩa là ở nồng độ pha loãng 1000 lần thì 1ml dịch virus có khả năng hủy hoại 50% số giếng tế bào sau 4 ngày xâm nhiễm.
Để tính hiệu giá các chủng virus PRRS phân lập được ta tiến hành chuẩn độ như sau:
2.6.7.1. Chuẩn bị tế bào MARC-145
Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Sau 24h tế bào phủ đáy lớp đơn sẽ được sử dụng để xác định hiệu giá virus.
2.6.7.2. Chuẩn bị dịch virus cần xác định hiệu giá
Tiến hành pha loãng dịch mẫu theo cơ số 10 (10-1 đến 10-10) như sau: -Cho vào 10 ống eppendorf, mỗi ống 900µl môi trường αMEM.
-Bổ sung 100µl dịch virus vào ống eppendorf 1. Dùng pipette đảo trộn đều ta được dịch pha loãng 10-1 rồi hút 100µl chuyển sang ống 2 ta được độ pha loãng 10-2. Pha loãng lần lượt đến độ pha loãng 10-10.
2.6.7.3. Thực hiện TCID50
-Loại bỏ môi trường nuôi cấy ở các giếng trong đĩa tế bào.
-Dùng multipipette cho vào mỗi giếng 100µl PBS rồi lắc nhẹ đĩa để rửa tế bào. Sau đó loại bỏ PBS.
-Bắt đầu với gây nhiễm tế bào với mẫu virus có độ pha loãng cao tới thấp 10-10 – 10-1. Mỗi độ pha loãng dùng 4 giếng, mỗi giếng 100µl. Ở các giếng đối chứng chỉ cho 100µl môi trường αMEM (không có FBS).
-Bố trí thí nghiệm như sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C C -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 D -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 E -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 F -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 G Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C Đ/C H
-Ủ đĩa nuôi cấy trong tủ ấm 370C, 5% CO2 trong 1-2h để virus xâm nhập vào tế bào.
-Dùng multipipette bổ sung vào mỗi giếng 100µl môi trường αMEM chứa 5% FBS. Tiếp tục nuôi trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) hàng ngày.
-Sau 72h, xác định sự có mặt của virus trong các giếng bằng cách quan sát CPE dưới kính hiển vi: các tế bào co cụm lại với nhau, chồi lên khỏi bề mặt nuôi cấy, khi tế bào bị virus phá hủy hoàn toàn thì bong khỏi đáy giếng.
-Đọc kết quả và tính TCID50 theo phương pháp Spearman-Karber Log TCID50 = E + d ( 0,5 - ) (TCID50/0,1ml)
Trong đó:
E: độ pha loãng cao nhất (E=10)
d: khoảng cách giữa các độ pha loãng (d=1) N: tổng số giếng ở mỗi độ pha loãng (N=4) r: số giếng âm tính (không xuất hiện CPE)