Mẫu phân và bệnh phẩm đem về được ria cấy trực tiếp trên môi trường MC rồi ủ ở 37oC trong 24 giờ. Chọn các khuẩn lạc E. coli to, tròn đều, hơi lồi, màu hồng đậm. Sau đó làm thuần vi khuẩn bằng cách chọn từ 3 – 5 khuẩn lạc điển hình dùng que cấy ria trên môi trường MC đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tiếp theo, khuẩn lạc được cấy sang môi trường TSA hoặc NA để kiểm tra sinh hóa và cuối cùng giữ giống.
Qui trình phân lập E. coli được thể hiện qua sơ đồ:
Mẫu phân (1g), bệnh phẩm (5g)
Cấy trên môi trường MC 370C/24h
Cấy thuần trên môi trường MC 370C/24h Cấy trên môi trường NA
370C/24h Kiểm tra đặc tính sinh hóa
KIA Indole VP Simmons’ Citrate MR 370C/24h E. coli dương tính 370C/24h NA Giữ giống
Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli sau khi được tăng sinh trên môi trường NA, tiến hành kiểm tra
đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trường KIA, LIM, VP, MR-VP và Simmons’ Citrat.
Môi trường KIA dùng để kiểm tra sự lên men đường glucose, lactose, sinh hơi và sinh H2S của vi khuẩn. Nếu vi khuẩn chỉ lên men đường glucose thì phần thạch nghiêng của môi trường có màu đỏ và phần thạch đứng có màu vàng. Nếu lactose được sử dụng thì cả hai phần thạch đứng và thạch nghiêng đều có màu vàng. Sự sinh hơi được ghi nhận bởi bọt khí hay sự bể, nứt của cột thạch. Nếu vi khuẩn sản sinh H2S thì môi trường sẽ có màu đen.
Môi trường LIM dùng để kiểm tra tính sinh Indole của vi khuẩn. Trên môi trường này, sau khi nhỏ thuốc thử Kovacs’ vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dương tính và ngược lại nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì Indole âm tính.
Môi trường VP dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường. Ngược lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường que cấy, môi trường xung quanh trong. Trên môi trường VP, sau khi cho thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngược lại, nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton.
Môi trường MR dùng để kiểm tra tính sử dụng đường của vi khuẩn. Nhỏ lên bề mặt môi trường vài giọt thuốc thử Methyl Red, phản ứng dương tính sẽ có vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường và ngược lại.
Môi trường Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương.
KIA LIM MR-VP VP Citrate
Hình 3.3: Sinh hóa khẳng định vi khuẩn E. coli
Hình 3.2: Khuẩn lạc E. coli trên môi trường MC
Bảng 3.1: Định danh vi khuẩn E. coli bằng phản ứng sinh hóa
Vi khuẩn
Di động
Glucose Lactose H2S Indole MR VP Simmons’
Citrate
E. coli + +h +h - + + - -
Klebsiella - +h +h + + - + +
Enterobacter + +h +h - - - - +
+h: lên men có sinh hơi, +: dương tính, -: âm tính