Mẫu vật thí nghiệm được thực hiện qua các giai đoạn:
Tiền tăng sinh trong môi trường Buffered Pepton Water. Cho tăm bông vô trùng đã có mẫu phân và các bệnh phẩm thí nghiệm vào 9 ml môi trường Buffered Pepton Water, đem ủ ở nhiệt độ 370C trong 24 giờ. Đây là bước nhằm hồi phục các tổn thương của vi khuẩn để phát triển tốt hơn ở các môi trường sau.
Tăng sinh trong môi trường Hajna Tetrathionate Broth: là môi trường giàu dinh dưỡng với tính chọn lọc, cho phép vi khuẩn Salmonella phát triển tốt và ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn cạnh tranh khác. Đây là bước quan trọng trong quá trình phân lập Salmonella. Dùng pipet vô trùng hút 1 ml canh khuẩn tiền tăng sinh sang 9 ml môi trường tăng sinh Hajna Tetrathionate Broth, đem ủ ở 370C trong 24 giờ. Phân lập trong môi trường MLCB: vi khuẩn sau khi tăng sinh trong môi trường Hajna Tetrathionate Broth được ria cấy lên môi trường MLCB. Sau khi cấy đem ủ ở nhiệt độ 370C, trong 24 giờ. Trên môi trường MLCB khuẩn lạc Salmonella to, tròn, màu đen viền xám nhạt, bề mặt hơi lồi, môi trường có màu tím xanh. Sau đó làm thuần vi khuẩn bằng cách chọn từ 3 – 5 khuẩn lạc điển rồi hình dùng que cấy ria trên thạch môi trường MLCB đem ủ ở 37oC trong 24 giờ. Tiếp theo, khuẩn lạc được cấy sang môi trường TSA hoặc NA để kiểm tra sinh hóa và cuối cùng là giữ giống.
Qui trình phân lập Salmonella được thể hiện qua sơ đồ: Mẫu phân (1g), bệnh phẩm (5g)
Buffered Peptone Water (9ml) 370C/24h Hajna Tetrathionate Broth (9ml)
370C/24h Cấy trên môi trường MLCB 370C/24h
Cấy thuần trên môi trường MLCB 370C/24h
Cấy trên môi trường NA 370C/24h Kiểm tra đặc tính sinh hóa
KIA LIM VP Simmons’ Citrate Urea 370C/24h Salmonella dương tính 370C/24h NA 370C/24h Giữ giống
Hình 3.4: Sơ đồ phân lập vi khuẩn Salmonella Phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn Salmonella
Tương tự như phương pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli. Vi
khuẩn Salmonella sau khi được tăng sinh trên môi trường NA, ta tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa của vi khuẩn trên các môi trường KIA, LIM, VP, Simmons’ citrate và urea.
Môi trường KIA dùng để kiểm tra sự lên men đường glucose, lactose, sinh hơi từ lên men đường glucose và sinh H2S của vi khuẩn. Vi sinh vật chỉ lên men đường glucose, không lên men glactose sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, phần thạch nghiêng trở nên có pH kiềm và phần sâu trong ống thạch đứng có pH acid. Do trong môi trường có chất chỉ thị Phenol Red nên phần thạch nghiêng có màu đỏ và phần thạch đứng có màu vàng (Trần Linh Thước, 2003). Sự sinh hơi được ghi nhận bởi bọt khí hay sự bể, nứt của cột thạch. Nếu vi khuẩn sản sinh H2S thì môi trường sẽ có màu đen. Do thành phần môi trường có chứa sodiumthiosulphate. Vi sinh vật sẽ khử hợp chất này tạo kết tủa màu đen FeS giữa H2S và ion Fe2+ của chỉ thị ferric amonium citrate có trong môi trường.
Môi trường LIM dùng để kiểm tra tính sử dụng lysine, tính sinh indole của vi khuẩn Salmonella. Tính sử dụng lysine là phản ứng dương tính nếu môi trường có màu tím đục. Nếu môi trường có màu vàng cam thì phản ứng âm tính. Thử khả năng sinh indole sau khi nhỏ thuốc thử Kovac’s vào nếu trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ thì phản ứng dương tính và ngược lại nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì indole âm tính.
Môi trường VP: dùng để kiểm tra tính di động và tính sinh aceton của vi khuẩn. Vi khuẩn có khả năng di động sẽ làm đục môi trường, có hình rễ cây do vi khuẩn đã mọc lan ra khỏi đường cấy. Ngược lại, vi khuẩn không có khả năng di động thì chỉ thấy vi khuẩn mọc theo đường que cấy, môi trường xung quanh trong. Trên môi trường VP, sau khi nhỏ thuốc thử VP1, VP2 vào nếu trên bề mặt môi trường có vòng đỏ thì chứng tỏ vi khuẩn có khả năng sinh aceton. Ngược lại, nếu trên bề mặt môi trường không xuất hiện vòng đỏ thì vi khuẩn không có khả năng sinh aceton. Môi trường Simmons’ citrate dùng để kiểm tra khả năng sử dụng citrate thay nguồn carbon của vi khuẩn. Trên môi trường này, vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ xanh lục sang xanh dương.
Môi trường urea dùng để kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn. Trên môi trường này vi khuẩn cho kết quả dương tính khi màu của môi trường chuyển từ không màu sang màu hồng. Ngược lại, nếu màu môi trường không thay đổi thì cho kết quả âm tính.
Bảng 3.2: Định danh vi khuẩn Salmonella bằng phản ứng sinh hóa
KIA LIM VP Simmons’
Vi khuẩn
Glu Lac H2S Gas Lys In VP DD Citrate
Urea
S. choleraesuis + - +/- + + - - + + -
S. typhimurium + - + - + - - + - -
Glu: Glucose; Lac: Lactose ; Lys: Lysine; In: Indole; DD: di động