3.1.1. Địa điểm
Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trƣờng Đại học Cần Thơ
3.1.2. Thời gian: 12/08/2013 → 04/12/2013
3.1.3. Nguyên liệu và hóa chất sử dụng
- Khoai lang tím giống Nhật Bản mua tại xã Thành Đông, huyện B nh Tân, tỉnh Vĩnh Long, chọn loại nguyên liệu đạt độ tuổi 4 – 5 tháng tuổi có độ ẩm khoảng 66,99 † 72%.
- Enzyme thƣơng mại: α-amylase là chế phẩm Termamyl SC do Công ty Novozymes (Đan Mạch) cung cấp, đƣợc sản xuất t Bacillus licheniformis,
Termamyl SChoạt động ở pH tối ƣu (5,1-5,3) và nhiệt độ tối ƣu (90-100o
C). - Enzyme thƣơng mại: glucoamylase – GA là chế phẩm Dextrozyme do Công ty Novozymes (Đan Mạch) cung cấp, đƣợc thu nhận t chủng nấm mốc
Aspergillus, GA hoạt động ở pH tối ƣu (4,1-4,3) và nhiệt độ tối ƣu (60-62oC). - CaCl2, NaOH, acid citric, HCl, KCl, CH3CO2Na.3H2O.
- Pb(CH3COO)2, Na2SO4, Na2CO3, dung dịch Fehling A và B, methyl xanh, nƣớc cất.
3.1.4. Thiết bị, dụng cụ
- Máy đo quang phổ UV Spectrophometer, SHMADZU, nhập t Công ty trách nhiệm hữu hạn và thiết bị khoa học kỹ thuật ASIMCO (Mỹ).
- Máy đo độ nhớt hiệu Brookield, Model: LVDV – E (Mỹ).
- Cân phân tích Ohaus Corp. Pine Brook, NJ (Mỹ). Max cap: 210 g, readability: 0,0001 g.
- Waterbath LAUDA edition 2000 (Đức). - Tủ sấy SIBATA (Nhật Bản).
Bếp hồng ngoại, Nồi hấp Bể điều nhiệt Waterbath pH kế Máy đo độ nhớt
Máy đo quang phổ Spectrophotometer Các dụng cụ thông thƣờng trong phòng thí nghiệm
3.2. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ enzyme α-amylase và thời gian đến khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang thời gian đến khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang
Mục đích: t m đƣợc nồng độ enzyme α-amylase và thời gian thích hợp cho quá tr nh dịch hóa tinh bột khoai lang.
Sơ đồ thí nghiệm:
Khoai lang hấp chín, nghiền mịn (Tỉ lệ khoai/nƣớc: 1/4 ; + 70 ppm Ca2+) Điều chỉnh pH đến giá trị thích hợp (pH 5,2)
Bổ sung enzyme α-amylase (3 mức độ) Nâng nhiệt đến giá trị thích hợp (95o
C)
Dịch hóa (3 mức thời gian) Làm nguội
Xác định độ nhớt dịch hồ tinh bột
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng dịch hóa tinh bột khoai lang
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức th a số 2 nhân tố, 3 lần lặp lại.
Nhân tố A: nồng độ enzyme (%), 3 mức độ A1: 0,02 A2: 0,25 A3:0,03 Nhân tố B: thời gian dịch hóa (phút), 3 mức độ B1:60 B2:120 B3:180
Nhân tố A
Nhân tố B
B1 B2 B3
A1 A1B1 A1B2 A1B3
A2 A2B1 A2B2 A2B3
A3 A3B1 A3B2 A3B3
Tổng số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Tổng số thí nghiệm: 9 x 3 = 27 Tiến hành thí nghiệm:
Cân 80 g khoai lang + 320 g nƣớc, cho vào cốc thủy tinh. Bổ sung 70 ppm Ca2+ (CaCl2). Chỉnh pH 5,2 (sử dụng acid citric và NaOH). Bổ sung enzyme α- amylase vào, lần lƣợt thay đổi nồng độ enzyme theo 3 mức độ trên. Nâng nhiệt lên giá trị tối ƣu 95oC và giữ ở nhiệt độ này để enzyme hoạt động, thời gian dịch hóa lần lƣợt thay đổi theo 3 mức độ trên. Sau khi dịch hóa, làm nguội nhanh bằng nƣớc đá.
Chỉ tiêu theo dõi: độ nhớt của dịch tinh bột sau dịch hóa.
Phƣơng pháp đánh giá: sử dụng thiết bị đo độ nhớt để xác định độ nhớt dịch tinh bột khoai.
Các số liệu đƣợc xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel và thống kê bằng chƣơng trình Statgraphics 15.
3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian đến khả năng đƣờng hóa tinh bột khoai lang thời gian đến khả năng đƣờng hóa tinh bột khoai lang
Mục đích: T m đƣợc nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian thích hợp cho quá tr nh đƣờng hóa tinh bột khoai.
Sơ đồ thí nghiệm:
Củ khoai lang hấp chín, nghiền mịn Dịch hóa
Điều chỉnh pH, nhiệt độ đến giá trị thích hợp (pH 4,2, t: 61o
C)
Bổ sung enzyme glucoamylase (3 mức độ) Đƣờng hóa (3 mức thời gian)
Vô hoạt enzyme Phân tích đƣờng khử
Hình 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng đƣờng hóa tinh bột khoai lang
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức th a số 2 nhân tố, 3 lần lặp lại.
Nhân tố C: nồng độ enzyme (%), 3 mức độ: C1: 0,055 C2: 0,06 C3:0,065 Nhân tố D: thời gian đƣờng hóa (giờ), 3 mức độ: D1:40 D2:70 D3:100
Nhân tố C Nhân tố D D1 D2 D3 C1 C1D1 C1D2 C1D3 C2 C2D1 C2D2 C2D3 C3 C3D1 C3D2 C3D3 Tổng số nghiệm thức: 3 x 3 = 9. Tổng số thí nghiệm: 9 x 3 = 27. Tiến hành thí nghiệm:
Cân 80 g khoai lang + 320 g nƣớc, cho vào cốc thủy tinh. Bổ sung 70 ppm Ca2+ (CaCl2). Tiến hành dịch hóa theo các thông số tối ƣu (pH dịch khoai 5,2, nồng độ enzyme α-amylase 0,02%, giữ nhiệt ở 95oC trong thời gian 180 phút). Chỉnh pH 4,2 (sử dụng acid citric và NaOH), nâng nhiệt độ 61oC. Bổ sung enzyme glucoamylase, lần lƣợt thay đổi nồng độ enzyme sử dụng theo 3 mức độ trên. Thay đổi thời gian đƣờng hóa theo 3 mức độ. Sau đƣờng hóa vô hoạt enzyme ở 85oC trong 5 phút.
Chỉ tiêu theo dõi: lƣợng đƣờng khử tạo thành.
Phƣơng pháp đánh giá: xác định hàm lƣợng đƣờng khử tạo thành bằng phƣơng pháp Lane-Eynon (Nguyễn Công Hà và Nguyễn Thị Thu Thủy, 2009).
Các số liệu đƣợc xử lí bằng phần mềm Microsoft Excel và thống kê bằng chƣơng trình Statgraphics 15.
3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và thời gian dịch hóa đến hàm lƣợng anthocyanin trong dịch khoai lang tím đến hàm lƣợng anthocyanin trong dịch khoai lang tím
Mục đích: Dựa trên các khoảng thời gian và nhiệt độ bố trí biết đƣợc chiều hƣớng biến động cụ thể của anthocyanin trong nguyên liệu.
Sơ đồ thí nghiệm:
Khoai lang hấp chín, nghiền mịn (Tỉ lệ khoai/nƣớc: 1/4 ; + 70 ppm Ca2+)
Điều chỉnh pH đến giá trị thích hợp (pH 5,2) Bổ sung enzyme α-amylase (0,02%) Nâng nhiệt đến giá trị thích hợp (3 mức nhiệt độ)
Dịch hóa (các điểm thời gian) Làm nguội
Lọc sơ bộ
Chuẩn bị mẫu phân tích theo phƣơng pháp vi sai AOAC Official Method 2005
Xác định lƣợng cyanidin-3-glucoside
Hình 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo độ bền anthocyanin trong quá trình thủy phân
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo thể thức th a số 2 nhân tố, 3 lần lặp lại.
Nhân tố E: nhiệt độ dịch hóa, 3 mức độ E1: 89oC, E2: 92oC, E3: 95oC
Nhân tố F: thời gian dịch hóa (phút), 8 mức độ ngẫu nhiên F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8 cho mỗi mức nhiệt độ
Nhân tố E
Nhân tố F
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
E1 E1F1 E1F2 E1F3 E1F4 E1F5 E1F6 E1F7 E1F8
E2 E2F1 E2F2 E2F3 E2F4 E2F5 E2F6 E2F7 E2F8
E3 E3F1 E3F2 E3F3 E3F4 E3F5 E3F6 E3F7 E3F8
Tổng số nghiệm thức: 8 x 3 = 24. Tổng số thí nghiệm: 24 x 3 = 72 Tiến hành thí nghiệm:
Cân 10 g khoai lang + 40 g nƣớc, cho vào bình tam giác 100 ml. Bổ sung 70 ppm Ca2+ (CaCl2). Chỉnh pH 5,2 (sử dụng acid citric và NaOH). Bổ sung enzyme α-amylase vào (0,02%). Nâng nhiệt lên giá trị cần khảo sát (89, 92 và 95oC) và giữ ở nhiệt độ này để enzyme hoạt động, thời gian dịch hóa lần lƣợt thay đổi theo 8 mức độ trên. Sau khi dịch hóa, làm nguội nhanh bằng nƣớc đá.
Chỉ tiêu theo dõi: Xác định lƣợng cyanidin-3-glucoside sau quá trình dịch hóa
Phƣơng pháp đánh giá: xác định hàm lƣợng cyanidin-3-glucoside trong quá trình dịch hóa bằng phƣơng pháp pH vi sai (AOAC 2005).
(Nguồn: Xác định hàm lượng anthocyanin trong một số nguyên liệu rau quả bằng phương pháp pH vi sai, Huỳnh Thị Kim Cúc và cộng sự, 2010)
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME α-AMYLASE VÀ THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG DỊCH HÓA TINH BỘT KHOAI LANG ĐẾN KHẢ NĂNG DỊCH HÓA TINH BỘT KHOAI LANG
Bảng 4.1. Kết quả đo độ nhớt (cP) Thời gian (giờ) Nồng độ (%) 60 120 180 Trung bình nghiệm thức 0,02 21,767 30,000 24,733 25,500ab 0,025 29,800 25,200 16,000 23,667a 0,03 32,467 33,000 23,133 29,533b Trung bình nghiệm thức 28,011 A 29,400A 21,289B
(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức độ ý nghĩa 5%. Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại).
Khi sử dụng enzyme α-amylase để dịch hóa ở các nồng độ và các mức thời gian khác nhau sẽ làm thay đổi độ nhớt của dịch khoai ở các mức độ khác nhau.
Kết quả thống kê (bảng 4.1) cho thấy khi thay đổi nồng độ enzyme α-amylase t 0,02 đến 0,025% th độ nhớt dịch khoai có giảm (không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5% về độ nhớt) và khi tăng nồng độ enzyme α-amylase t 0,025 đến 0,03% th độ nhớt dịch khoai tăng (có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5% về độ nhớt). Tuy nhiên, khi xét ở hai mức nồng độ enzyme α-amylase là 0,02 và 0,03% th độ nhớt dịch khoai tăng (không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%). Qua các kết quả phân tích trên cho thấy khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside của enzyme α- amylase càng tăng khi ta tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất và enzyme, nhƣng do cơ chất đã không còn nhiều nên sản phẩm đƣợc thu hồi sẽ giảm dần khi ta tiếp tục tăng nồng độ enzyme (tuy nhiên không đáng kể).
Về mặt thời gian, bảng 4.1 cũng cho thấy độ nhớt dịch khoai có sự thay đổi ở các mức thời gian khác nhau. Không có sự khác biệt ý nghĩa 5% ở mức thời gian 60 và 120 phút. Khi khảo sát ở mức 180 phút th độ nhớt dịch khoai giảm đáng kể (có sự khác biệt ý nghĩa 5% ở hai mức thời gian 60, 120 phút với 180 phút). V thời gian càng dài càng tăng khả năng tiếp của cơ chất và enzyme.
Theo kết quả phân tích th chúng ta sẽ chọn thời gian dịch hóa là 180 phút và nồng độ enzyme α-amylase là 0,02% để có đƣợc hiệu quả tốt nhất cũng nhƣ đảm bảo
anthocyanin trong sản phẩm không bị ảnh hƣởng quá mức, do nhiệt độ dùng trong thí nghiệm này khá cao (95oC) nếu kéo dài thời gian sẽ ảnh hƣởng đến độ bền của anthocyanin cũng nhƣ giảm hiệu ứng cƣờng độ màu sắc (Sikorski, 2002).
Vậy nồng độ enzyme α-amylase 0,02% ở thời gian 180 phút là tối ƣu nhất.
4.2. ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ENZYME GLUCOAMYLASE VÀ THỜI GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG ĐƢỜNG HÓA TINH BỘT KHOAI LANG GIAN ĐẾN KHẢ NĂNG ĐƢỜNG HÓA TINH BỘT KHOAI LANG
Bảng 4.2. Kết quả phân tích hàm lƣợng đƣờng khử khi đƣờng hóa ở các mức nồng độ enzyme glucoamylase và thời gian khác nhau (%)
Thời gian (giờ) Nồng độ (%) 40 70 100 Trung bình nghiệm thức 0,055 4,555 5,518 5,496 5,190a 0,06 4,669 5,433 5,716 5,273a 0,065 4,909 5,473 5,684 5,355a Trung bình nghiệm thức 4,711 A 5,475B 5,632B
(Ghi chú: Các chữ cái khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa các nghiệm thức ở mức độ ý nghĩa 5%. Số liệu thể hiện trong bảng là giá trị trung bình của ba lần lặp lại).
Khi sử dụng enzyme glucoamylase để đƣờng hóa ở các nồng độ và các mức thời gian khác nhau sẽ làm thay đổi hàm lƣợng đƣờng khử của dịch khoai ở các mức độ khác nhau.
Kết quả thống kê (bảng 4.2) cho thấy hàm lƣợng đƣờng khử tăng nhanh ngay khi tăng thời gian đƣờng hóa, quá tr nh diễn ra nhanh t 40 lên 70 giờ và hầu nhƣ không đổi t 70 đến 100 giờ, v thời gian càng dài càng tăng khả năng tiếp xúc của cơ chất và enzyme, nhƣng do cơ chất đã không còn nhiều nên sản phẩm đƣợc thu hồi khi tăng thời gian là không đáng kể.
Về mặt nồng độ, bảng 4.2 cho thấy hàm lƣợng đƣờng khử tăng khi ta bổ sung enzyme glucoamylase (nhƣng không có sự khác biệt ý nghĩa ở mức 5%) chứng tỏ khả năng phân cắt mạnh mẽ cả liên kết 1,4 và 1,6-glucoside trong tinh bột của enzyme glucoamylase, nhƣng khi tinh bột đƣợc chuyển hóa hầu nhƣ hoàn toàn thành đƣờng th dù tăng thêm enzyme lƣợng sản phẩm hầu nhƣ không đổi.
Vậy ở nồng độ enzyme glucoamylase 0,055% với thời gian 70 giờ cho kết quả thu hồi đƣờng tốt nhất.
4.3. ẢNH HƢỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN DỊCH HÓA ĐẾN HÀM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG DỊCH KHOAI LANG TÍM LƢỢNG ANTHOCYANIN TRONG DỊCH KHOAI LANG TÍM
Hình 4.1. Sự biến động hàm lƣợng anthocyanin theo nhiệt độ và thời gian
Theo đồ thị (Hình 4.1), hàm lƣợng anthocyanin ở 3 mức nhiệt độ khảo sát (89, 92 và 95oC) nhìn chung đều giảm theo thời gian dịch hóa. So sánh hàm lƣợng anthocyanin ở cuối quá trình dịch hóa với thời điểm có hàm lƣợng anthocyanin cao nhất (ở đây ta chọn tại thời điểm 5 phút) cho thấy:
Ở mức nhiệt độ 89o
C, sau thời gian 180 phút dịch hóa thì hàm lƣợng anthocyanin giảm 10,64%.
Cùng một thời gian dịch hóa trên, hàm lƣợng anthocyanin đã giảm 11,52% khi đƣợc dịch hóa ở 92o
C.
Ở nhiệt độ dịch hóa 95oC, hàm lƣợng anthocyanin giảm 11,34% khi dịch hóa với thời gian 60 phút.
Sự giảm hàm lƣợng anthocyanin trong quá trình dịch hóa do bị tác động của các yếu tố sau:
Nhiệt độ: Khi tăng nhiệt độ sẽ làm giảm độ nhớt đồng thời làm tăng vận tốc khuếch tán. Do đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển hóa các chất hòa
tan t trong nguyên liệu vào dung môi. Tuy nhiên chất màu anthocyanin dễ bị phá hủy ở nhiệt độ cao, dẫn đến làm giảm đáng kể hàm lƣợng anthocyanin. Nhiệt độ là nhân tố đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định cấu trúc của phân tử anthocyanin. Việc gia tăng nhiệt độ làm gia tăng sự phân hủy anthocyanin. Theo Palamidis và Markakis (1978) nghiên cứu về ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự ổn định của anthocyanin, khi tăng nhiệt độ trong kho trữ sẽ làm tăng khả năng phân hủy của các anthocyanin trong thức uống nhẹ.
Thời gian: thời gian dịch hóa dài có thể làm giảm hàm lƣợng anthocyanin do anthocyanin bị phân hủy dƣới tác dụng của các tác nhân khác (ánh sáng…)
Ánh sáng cũng là nhân tố ảnh hƣởng đến tính ổn định của anthocyanin. Theo Palamidis và Markakis (1978) đã nghiên cứu về ảnh hƣởng của ánh sáng đối với sự ổn định của anthocyanin trong nƣớc nho và quá trình bóc vỏ nho. Dƣới tác dụng của ánh sáng có đến 50% hợp chất màu anthocyanin bị phá hủy nhƣng chỉ có 30% hợp chất màu anthocyanin bị phá hủy khi thực hiện trong điều kiện tối ở cùng điều kiện nhiệt độ (20oC) và thời gian (135 ngày). Tuy nhiên, trong thí nghiệm này, thời gian dịch hóa kéo dài nhất chỉ là 180 phút, là khoảng thời gian tƣơng đối ngắn, chính vì vậy ánh sáng có làm giảm hàm lƣợng anthocyanin nhƣng sẽ không đáng kể.
Trong thời gian đầu của quá trình dịch hóa (t 0 đến 5 phút) hàm lƣợng anthocyanin ở 3 mức nhiệt độ có sự biến động theo chiều hƣớng tăng lên. Điều này có thể đƣợc giải thích:
Ở thời gian 0 phút: thời gian thủy phân quá ngắn không đủ để enzyme α- amylase hoạt động phân cắt hạt nguyên liệu làm giải phóng chất màu.
Ở thời gian 5 phút: khi tăng nhiệt độ làm giảm độ nhớt đồng thời làm tăng vận tốc khuếch tán. Do đó, tạo điều kiện thuận lợi cho việc chuyển các chất hòa tan t trong nguyên liệu vào môi trƣờng. Trong thời gian 5 phút, enzyme tác động quá trình dịch hóa, giải phóng cấu trúc nguyên liệu. Việc đó tạo hiệu ứng giải phóng chất màu.
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Sau quá tr nh thực thí nghiệm, nghiên cứu các tài liệu tham khảo, tổng hợp các kết quả chúng tôi rút ra đƣợc những kết luận sau:
Để đạt hiệu suất thủy phân tinh bột khoai lang tím cao th việc sử dụng kết hợp nồng độ enzyme α-amylase 0,02% trong 180 phút và nồng độ enzyme glucoamylase 0,055% trong thời gian 70 giờ sẽ cho kết quả tốt nhất. Đồng thời, theo thời gian và nhiệt độ dịch hóa cũng làm biến động hàm lƣợng anthocyanin có trong dịch khoai.
5.2. ĐỀ NGHỊ
V thời gian nghiên cứu hạn hẹp nên vẫn còn nhiều vấn đề chƣa đƣợc t m hiểu. Để nghiên cứu hoàn thiện hơn, chúng tôi đề nghị:
Nghiên cứu thêm về hàm lƣợng Ca2+ bổ sung trong quá tr nh thủy phân, các yếu tố ức chế hoặc hoạt hóa phản ứng ảnh hƣởng đến 2 loại enzyme trên.
Nghiên cứu thêm về thời gian đƣờng hóa gần nhau hơn để có đƣợc kết quả chính xác hơn.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian đƣờng hóa đến chất màu anthocyanin