Nấm Dai là loại nấm hoang dại, nấm mọc theo mùa, từ lâu nay nấm chủ yếu được khai thác một cách tự phát chứ chưa có quá trình nuôi cấy một cách cụ thể do vậy mà các thông tin nghiên cứu về loại nấm Dai này còn rất hạn chế chỉ có một số thông tin như của Hoàng Thanh Tú, Trịnh Tam Kiệt (2009) nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm phễu da báo Lentinus tigrinus (Bull.) Fr (Hoàng Thanh Tú, Trịnh Tam Kiệt, 2009)[3].
PHẦN 3
VẬT LIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng: Nấm Dai - Lentinus tigrinus (Bull.) Fr được thu nhận tại địa điểm xã Na Mao - huyện Đại Từ - tỉnh Thái Nguyên.
Quy mô nghiên cứu: Quy mô phòng thí nghiệm.
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ Lên men Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian: Từ tháng 11/2016 đến tháng 5/2017.
3.3. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
* Hóa chất
Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
Tên hoá chất Xuất xứ
Peptone Trung Quốc
CaCO3 Việt Nam
HCL Trung Quốc
NaOH Trung Quốc
Agar Việt Nam
Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Tên thiết bị Xuất xứ Tên thiết bị Xuất xứ
Nồi hấp thanh trùng Trung Quốc Cân phân tích Trung Quốc Tủ sấy Trung Quốc Máy đo pH Trung Quốc Tủ ấm Trung Quốc Kính hiển vi Việt Nam Box cấy Trung Quốc Máy UV – VIS Việt Nam
Các dụng cụ khác được sử dụng trong thí nghiệm bao gồm: Chai, bình tam giác, que cấy, que trang, đĩa petri, ống nghiệm, đèn cồn, giá đỡ ống nghiệm,…
3.4. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập giống nấm Dai.
Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại thóc đến sự phát triển của hệ sợi nấm.
Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thể đến sự hình thành thể quả.
Nội dung 4: Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật giảm giá thành sản phẩm
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu
- Thu nhận quả thể còn tươi, kích thước lớn, không bị dập, nát và không bị thối nhũn.
- Chụp ảnh địa điểm nấm mọc, chụp ảnh thể quả nấm, toàn bộ thể quả được đào lên bằng dao sắc nhọn sao cho không làm thể quả nấm bị đứt gãy.
- Đưa thể quả vào túi nilon hoặc hộp đựng mẫu vô trùng, vận chuyển nhanh chóng về phòng thí nghiệm.
- Bảo quản thể quả nấm ở nhiệt độ 5°C - Thời gian bảo quản từ 3-5 ngày
Hình 3.1: Hình ảnh địa điểm nấm mọc
3.5.2. Phương pháp phân lập
Giống gốc là giống được phân lập trực tiếp từ thể quả nấm, bào tử của nấm hoặc sợi nấm. Giống gốc quyết định rất lớn đến năng suất của nấm trong quá trình nuôi trồng nấm.
Các bước phân lập từ thể quả nấm:
- Chuẩn bị môi trường nhân giống cấp 1 môi trường thạch agar dịch chiết khoai tây hoặc hỗn hợp thóc và 1% bột nhẹ.
- Dùng tay tách đôi thể quả nấm sau đó dùng dao đã khử trùng dưới ngọn lửa đèn cồn cắt lấy những mảnh mô nấm sạch, hạn chế mức tối thiểu khả năng nhiễm nấm, vi sinh vật khác.
- Cấy phần thịt nấm đã cắt môi trường đã chuẩn bị
- Đem đĩa/chai môi trường đã cấy nấm, ủ ở 30oC trong 2-3 ngày, ít ánh sáng, theo dõi, kiểm tra và ghi lại kết quả sự phát triển của sợi nấm
Chuẩn bị môi trường dịch chiết khoai tây (PDA):
Chuẩn bị nguyên liệu:
- Khoai tây 200g - Agar 20g - Đường Glucose 20g - Pepton 4g - Nước 1 lít Các bước tiến hành:
Bước 1- Cân lấy 200 g khoai tây đã được rủa sạch, gọt vỏ rồi cắt nhỏ thành hình khối khoảng 1cm
Bước 2- Cho khoai vào nồi rồi thêm khoảng 800 ml nước, đun sôi khoảng 25-30 phút
Bước 3- Lọc lấy dịch chiết
Bước 4- Bổ sung đường, agar, pepton, rồi chuẩn lên 1 lít Bước 5- Chuẩn pH=7.0
Bước 6- Cho vào chai lọ rồi hấp khử trùng(121°C trong 30 phút). Cho vào đĩa petri hoặc chai lọ đựng môi trường, để nguội và cấy mẫu.
Chuẩn bị hỗn hợp thóc, bột nhẹ
- Cân lượng thóc cần dùng, rửa nhiều lần với nước sạch để loại bỏ bụi bẩn, thóc lép. Ngâm thóc trong nước sạch khoảng 12-16 giờ để thóc ngậm nước.
- Cho thóc vào nồi, cho lượng nước vừa ngập toàn bộ thóc, đun thóc trong khoảng 30 phút, cho đến khi thóc nứt hạt.
- Vớt thóc ra để ráo nước khoảng 15 phút. - Bổ sung 1% bột nhẹ, trộn đều.
- Cho thóc vào túi nilon chịu nhiệt (hoặc lọ thủy tinh) với lượng vừa đủ, đậy nắp bằng nút bông.
- Hấp khử trùng ở 121°C trong thời gian 30 phút. - Để nguội và cấy giống.
- Ủ ở 30oC trong 2-3 ngày, ít ánh sáng, theo dõi, kiểm tra và ghi lại sự phát triển của hệ sợi.
3.5.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại thóc đến sự phát triển của hệ sợi nấm của hệ sợi nấm
Thóc là cơ chất rất phổ biến để sản xuất meo nấm ăn và nấm dược liệu nói chung vì chúng giàu chất dinh dưỡng, rẻ tiền và rất dễ kiếm ở Việt Nam. Mặt khác các loại meo nấm trên thóc đã cho thấy kết quả thực tiễn rất tốt, được nhiều địa chỉ sản xuất meo giống nấm sử dụng như Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội hay khoa Công nghệ sinh học- Công nghệ thực phẩm, Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Tuy nhiên các loại thóc khác nhau sẽ có độ nở của hạt khác nhau. Điều này có tác động rất lớn tới quy trình làm meo nấm. Để tìm ra loại thóc tốt nhất cho quy trình sản xuất meo giống nấm Dai, các loại thóc có sẵn tại địa phương gồm: Thóc Khang dân, thóc Tạp giao, thóc non, thóc lẫn
tạp (rẻ tiền) được thử nghiệm và đánh giá chất lượng meo giống trên từng loại thóc.
Quá trình chuẩn bị các loại thóc được tiến hành giống nhau, cụ thể: - Cân lượng thóc cần dùng, rửa nhiều lần với nước sạch để loại bỏ bụi bẩn thóc lép. Ngâm thóc trong nước sạch khoảng 12-16 giờ để thóc ngậm nước.
- Cho thóc vào nồi, cho lượng nước vừa ngập toàn bộ thóc, đun thóc trong khoảng 30 phút, cho đến khi thóc nứt hạt.
- Vớt thóc ra để ráo nước khoảng 15 phút.
- Bổ sung 1% bột nhẹ theo công thức, rồi trộn đều.
- Cho thóc vào túi nilon chịu nhiệt (hoặc lọ thủy tinh) với lượng vừa đủ, đậy nắp bằng nút bông.
- Hấp khử trùng ở 121°C trong thời gian 30 phút. - Để nguội và cấy giống.
- Ủ ở 30oC trong 2-3 ngày, ít ánh sáng, theo dõi, kiểm tra và ghi lại sự phát triển của hệ sợi.
3.5.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại giá thểđến sự hình thành thể quảa) Thí nghiệm 1: Giá thể là rơm rạ a) Thí nghiệm 1: Giá thể là rơm rạ
- Rơm rạ được chặt ngắn 10-15cm, ngâm trong nước vôi 1% 15-20 phút. - Vớt ra bổ sung 1% bột nhẹ (CaCO3), 5% cám ngô hoặc cám gạo.
- Cho nguyên liệu vào trong túi nilon chịu nhiệt, trọng lượng túi 1,5-2kg, nút cổ nút bằng ống nhựa và bông thấm nước.
- Hấp khử trùng 121 °C trong thời gian 90 phút. - Lấy nguyên liệu ra để nguội, cho vào tủ cấy giống. - Chuyển vào phòng nuôi.
- Chọn những bịch có sợi tơ nấm mọc trắng đều bịch, sau đó tiến hành tháo nút bông phía trên miệng bịch phôi hoặc dùng dao lam rạch từ 3 – 4 đường dài khoảng 3 – 4cm trên bịch phôi, sau khi rạch bịch để ngày hôm sau mới phun tưới nước.
- Ươm sợi với thời gian ươm kéo dài 20 - 30 ngày. Trong thời gian ươm sợi không di chuyển bịch nấm.
- Nước tưới nấm phải sạch, không phèn, không chứa chất độc hại nấm và nên tưới bằng bình phun sương. Trung bình 2 lần/ngày, nếu khô thì từ 3 – 4 lần/ngày. Độ ẩm môi trường không khí nơi trồng nấm đạt 85-90%. Nhiệt độ thích hợp 25-32°C, nhiệt độ tối ưu 30-32°C. Ánh sáng đây là điều kiện thích hợp nhất để tạo quả thể nấm phát triển.
b) Thí nghiệm 2: Giá thể là mùn cưa cây lá rộng
- Xử lý nguyên liệu: Mùn cưa làm ướt (số lượng lớn ủ lại 4-6 ngày, số lượng nhỏ có thể luộc vớt ra để ráo nước).
- Bổ sung 5% cám ngô hoặc cám gạo, 1% bột nhẹ tỷ lệ theo công thức trong thí nghiệm độ ẩm 65-70%.
- Cho nguyên liệu vào trong túi nilon chịu nhiệt, trọng lượng túi 1,5-2kg, nút cổ nút bằng ống nhựa và bông thấm nước.
- Hấp khử trùng 121 °C trong thời gian 90 phút. - Lấy nguyên liệu ra để nguội, cho vào tủ cấy giống. - Chuyển vào phòng nuôi.
- Chọn những bịch có sợi tơ nấm mọc trắng đều bịch, sau đó tiến hành tháo nút bông phía trên miệng bịch phôi hoặc dùng dao lam rạch từ 3 – 4 đường dài khoảng 3 – 4cm trên bịch phôi, sau khi rạch bịch để ngày hôm sau mới phun tưới nước.
- Ươm sợi với thời gian ươm kéo dài 20 - 30 ngày. Trong thời gian ươm sợi không di chuyển bịch nấm.
- Nước tưới nấm phải sạch, không phèn, không chứa chất độc hại nấm và nên tưới bằng bình phun sương. Trung bình 2 lần/ngày, nếu khô thì từ 3 – 4 lần/ngày. Độ ẩm môi trường không khí nơi trồng nấm đạt 85-90%. Nhiệt độ thích hợp 25-32°C, nhiệt độ tối ưu 30-32°C. Ánh sáng đây là điều kiện thích hợp nhất để tạo quả thể nấm phát triển.
c) Thí nghiệm 3: Giá thể là cành nhỏ cây lá rộng
- Cành cây nhỏ chặt đoạn ngắn khoảng 1-2cm.
- Đem cành cây nhỏ đã chặt luộc với dịch chiết gạo 2 giờ. - Vớt ra để ráo nước khoảng 10-15 phút.
- Cho nguyên liệu vào trong túi nilon chịu nhiệt, trọng lượng túi 1,5-2kg, nút cổ nút bằng ống nhựa và bông thấm nước.
- Hấp khử trùng 121 °C trong thời gian 90 phút. - Lấy nguyên liệu ra để nguội, cho vào tủ cấy giống. - Chuyển vào phòng nuôi.
- Chọn những bịch có sợi tơ nấm mọc trắng đều bịch, sau đó tiến hành tháo nút bông phía trên miệng bịch phôi hoặc dùng dao lam rạch từ 3 – 4 đường dài khoảng 3 – 4cm trên bịch phôi, sau khi rạch bịch để ngày hôm sau mới phun tưới nước.
- Ươm sợi với thời gian ươm kéo dài 20 - 30 ngày. Trong thời gian ươm sợi không di chuyển bịch nấm.
3.5.5. Nghiên cứu cải tiến kỹ thuật giảm giá thành sản phẩm
a) Cải tiến nút bông
Bông là nguyên liệu phổ biến được sử dụng để bịt kín ống nghiệm giống gốc, bình tam giác và các chai túi giống. Bông có hệ thống các sợi nhỏ chằng chịt có thể ngăn cản các vi sinh vật, bụi di chuyển vào môi trường dinh dưỡng trong dụng cụ thí nghiệm mà vẫn đảm bảo cung cấp không khí cho mẫu. Tuy nhiên trong quá trình sản xuất giống nấm, các chai thủy tinh đựng giống có miệng rất rộng, mặt khác số lượng chai giống rất lớn, hoàn toàn không thể làm nút bông theo cách thông thường. Với những túi meo giống 2 đầu, số lượng nút bông cũng tăng gấp 2 lần so với thông thường, một cây bông nặng 1 kg chỉ đủ làm nút bông cho 1 yến giống, đủ cấy cho 700-800 bịch cơ chất, chi phí hết 160 nghìn Việt Nam đồng (VND) mà một vụ nấm của người nông dân trồng vài vạn bịch nấm, như vậy chi phí cho nút bông là rất lớn. Do nguyên liệu làm meo
nấm tốn kém, giá thành của meo nấm phải tăng gây nên áp lực cho cả cơ sở sản xuất giống nấm và người dân. Vì vậy, các nguyên liệu ít tốn kém hơn được thử nghiệm để hạn chế những chi phí phát sinh trong quá trình sản xuất meo nấm.
Nguyên liệu thay thế được lựa chọn trình bày trong báo cáo này là giấy ăn ( giấy vệ sinh), cụ thể:
Giấy ăn được tách 1 mảnh đủ rộng sao cho che kín được miệng chai thủy tinh đựng meo giống, đậy lên trên 1 lớp giấy bóng cùng kích thước, buộc quanh bằng dây chun (dây nịt) 2 vòng. Kế tiếp, chai được đem khử trùng bằng nồi hấp, để nguội và cấy giống. Theo dõi trong 7 ngày đầu và đánh giá tình hình nấm mọc. Với chai thủy tinh thể tích 500 ml, thời gian mọc kín chai khoảng 20 ngày là đạt yêu cầu (Người dân luôn đặt mua giống trước 20 ngày).
b) Rút ngắn thời gian sản xuất meo giống
Thời gian sản xuất meo giống thông thường là 20 ngày. Tuy nhiên nhiều trường hợp người dân cần giống nấm trong thời gian rất ngắn, ví dụ trong trường hợp điều kiện bất lợi, giống nấm cấy bị hỏng hay bị thiếu hụt, người dân sẽ cần giống bổ sung trong thời gian ngắn nhất có thể. Xuất phát từ thực tế trên, kỹ thuật sản xuất meo giống được thử nghiệm thay đổi từ dạng túi 1 đầu thành túi 2 đầu, cụ thể:
Bước 1: Chuẩn bị túi bóng thể tích khoảng 500ml, dùng kéo cắt 2 đầu túi Bước 2: Làm nút bông cho 1 đầu miệng túi
Bước 3: Cho thóc vào túi và làm nút bông cho đầu miệng túi còn lại Bước 4: Khử trùng bằng nồi hấp, thời gian 30 – 60 phút
Bước 5: Để nguội và cấy giống
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập nấm Dai bằng phương pháp nuôi cấy mảnh mô
4.1.1. Kết quả thu nhận và xử lý mẫu
Thể quả nấm Dai được thu nhận ở giai đoạn xòe rộng, vẫn giữ được hình dạng nguyên vẹn, không bị dập nát. Thể quả được cất giữ trong túi nilon vô trùng hay hộp đựng mẫu vô trùng làm hạn chế các tác động từ bên ngoài như bụi bẩn, các vi sinh vật …trong khi di chuyển. Mẫu thể quả nấm được phân lập ngay hoặc bảo quản trong điều kiện nhiệt độ 50C, phục vụ cho quá trình phân lập ở giai đoạn tiếp theo.
4.1.2. Kết quả phân lập mảnh mô
Hình 4.1: Hình ảnh nấm Dai sau khi thu nhận
Mảnh mô của nấm Dai sau khi phân lập được cấy trên môi trường thạch khoai tây chuyển vào tủ ấm điều kiện nhiệt độ tối ưu 30-32oC, ít ánh sáng để phát triển hệ sợi. Tuy nhiên trong lần phân lập đầu tiên 100% các đĩa môi trường bị nhiễm vi khuẩn, không thu được giống nấm như dự kiến. Nguyên nhân có
thể do môi trường khoai tây giàu chất dinh dưỡng, rất dễ nhiễm vi khuẩn và tốc độ phát triển của vi khuẩn trên môi trường này rất lớn, lấn át sự phát triển của nấm. Bên cạnh đó cũng có những yếu tố khách quan như các vấn đề về thiết bị (trong quá trình thực tập, thí nghiệm bị dừng 1 tháng do sự cố về điện và hỏng hóc thiết bị).
Để giải quyết vấn đề trên, môi trường phân lập được thay đổi sang môi trường thóc, thường sử dụng để làm meo giống. Sau 1 tuần, sợi nấm Dai ăn kín bề mặt cơ chất, không quan sát thấy các vùng thóc bị nát (thường do nhiễm khuẩn hoặc xử lý thóc quá nhiều nước) (Hình 4.2).
Hình 4.2: Phân lập mảnh mô nấm Dai trên hỗn hợp thóc + 1% bột nhẹ
Việc sử dụng hỗn hợp thóc, bột nhẹ để phân lập nấm trong thực tế không phổ biến vì so với môi trường PDA, chai thóc rất khó quan sát và không đánh giá được meo giống có bị nhiễm vi khuẩn hay không. Tuy nhiên ưu điểm của
phương pháp này là thời gian thu nhận hệ sợi tương đương với môi trường thạch PDA, một đĩa petri PDA có thể cấy ra 30 – 40 đĩa/ chai cơ chất meo nấm, nhưng một chai thóc có thể cấy ra 60- 80 chai thóc khác trong quá trình nhân giống cấp 2. Hơn nữa với loại nấm có sức sống mạnh như nấm dai, sợi nấm có