2.2.5.1. Phương phỏp định lượng glucose huyết
* Nguyờn tắc:
Nguyờn tắc hoạt động của phương phỏp dựa trờn chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương phỏp quang học để định lượng glucose huyết.
+ Phản ứng 1: Khi mỏu tiếp xỳc với bề m t của vựng phản ứng que thử, dưới xỳc tỏc đ c hiệu của glucose oxidase (GOD) cú trong kớt thử, glucose trong mỏu phản ứng với oxy (khụng khớ) tạo thành axit gluconic và hydro peroxide (H2O2).
+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong mỏy One Touch Ultra chuyển húa định lượng biểu thị bằng số mmol/L ho c mg/dl glucose.
* Tiến hành: Ấn nỳt điều khiển để khởi động mỏy. Gắn que thử vào mỏy. Dựng kim chõm chuyờn dụng chõm vào mạch mỏu ở đuụi chuột, để mỏu chảy tự nhiờn, thấm bỏ giọt đầu tiờn, lấy giọt mỏu thứ 2. Mẫu mỏu dựng cho việc đo là 1àL, phải là giọt mỏu trũn đầy, phủ kớn giọt mỏu lờn vựng phản ứng của que thử. Sau 5 giõy, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trờn màn hỡnh.
2.2.5.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh
Cỏc chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xỏc định trờn mỏy xột nghiệm sinh húa tự động (Phũng húa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xụ). Nguyờn tắc xỏc định của mỗi chỉ số như sau:
a) Định ượng triglycerid
Thuỷ phõn triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phúng ra bằng phương phỏp đo màu của quynonimin tạo thành từ
4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo cỏc phản ứng sau:
Triglycerid Glycerol + acid bộo
Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihidroxyacetone + H2O2
H2O2 + Aminoantipyrine + 4- chlorophenol Quynonimin + 4HCl + 4H2O
Đo mật độ quang học quynonimin ở bước súng 546nm (mỏy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tớnh kết quả.
b) Định ượng cholesterol toàn phần
Thuỷ phõn cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoỏ bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin tạo nờn từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone với phenol nhờ xỳc tỏc của peroxydase. Cỏc phản ứng:
Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid bộo Cholesterol + O2 Chlesterol-3-one + H2O
H2O2 + 4-aminophenazone + Phenol Quynonimin + H2O Đo mật độ quang của Quynonimin ở bước súng 546nm (bằng mỏy Olympus AU400), so với ống chuẩn để tớnh kết quả.
c) Định ượng HDL-c
Nguyờn tắc: Xột nghiệm gồm hai bước đ c hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phỏ hủy bằng cỏc phản ứng enzyme đ c hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự cú m t của chất surfactant đ c hiệu cho HDL Lipase Glycerolkinase GPO Peroxydase CHE CHO Peroxydase
Bước 1: Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon + H2O 2H2O2 2 H2O + O2 Bước 2: HDL Cholestenon + H2O2 H2O2 + Chromogen Sắc tố quynon 2.2.6. Xử lý số liệu
Chỉ số glucose huyết được so sỏnh giữa thời điểm trước và sau nghiờn cứu; so sỏnh giữa cỏc lụ dựng thuốc và lụ đối chứng ở cựng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tớnh theo cụng thức
Tỷ lệ tăng glucose huyết:
X1% =
X1 – Tỷ lệ tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đỏnh giỏ
Sự khỏc biệt được kiểm định bằng thuật toỏn t- test student với P < 0.05 cú ý nghĩa thống kờ.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tớnh theo cụng thức dưới đõy Tỷ lệ % hạ glucose huyết: X2% = X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết B – A A x 100 B - A A x 100 CHE + CHO
Điều kiện đặc biệt
Catalase
CHE + CHO Surfactant đặc hiệu
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đỏnh giỏ
Sự khỏc biệt được kiểm định bằng thuật toỏn t- test student với P< 0.05 cú ý nghĩa thống kờ.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỏch chiết cỏc phõn đ ạn dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm (Morus alba L.)
3.1.1. Quy trỡnh tỏch chiết cỏc phõn đ ạn dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm
Hỡnh 3.1. Quy trỡnh chiết xuất cỏc chất tự nhiờn từ lỏ cõy Dõu tằm
Bó sau khi chiết bằng n –hexan 39.6g Cao
n –hexan
Chiết bằng n –hexan
Bó sau khi chiết bằng ethylacetate 32g Cao
ethylacetate 150g Cao ethanol Bó sau khi chiết
bằng ethanol
Chiết ethanol 3 lần 3000g lỏ cõy Dõu tằm khụ
Chiết bằng ethylacetate
Từ 3 kg bột lỏ cõy Dõu tằm khụ được ngõm kiệt 3 lần trong ethanol 80%, loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số là 200g. Giữ lại 50g dựng cho quỏ trỡnh phõn tớch và điều trị cho chuột, khối lượng cao cồn cũn lại (150g) dựng để tỏch chiết qua cỏc dung mụi hữu cơ cú độ phõn cực khỏc nhau. Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua cỏc dung mụi của lỏ cõy Dõu tằm được trỡnh bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khối lượng cao thu được khi chiết qua cỏc phõn đ ạn và hiệu suất
Mẫu Cỏc PĐ
Lỏ Dõu tằm
Mẫu an đầu (g) Mẫu khụ
tuyệt đối (g) Hiệu suất chiết rỳt (%) EtOH 150 23.5 15,7 N-Hexan 39.6 1.7 4.3 Ethylacetate 32 1.12 3.5
(Tớnh theo nguyờn liệu khụ ban đầu)
Từ phương phỏp chiết rỳt được trỡnh bày ở hỡnh 3.1, chỳng tụi đó thu được một số cao phõn đoạn tan trong cỏc dung mụi hữu cơ cú độ phõn cực khỏc nhau để sử dụng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.1.2. Kết quả định tớnh cỏc hợp chất tự nhiờn tr ng cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm
Chỳng tụi tiến hành định tớnh thành phần một số hợp chất tự nhiờn thụng qua cỏc phản ứng húa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 .Bảng kết quả định tớnh một số hợp chất tự nhiờn trong cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm
Chỳ thớch:
(-): Khụng phản ứng (+): Phản ứng
(++): Phản ứng mạnh
Kết quả trỡnh bày ở bảng 3.2 cho thấy một số phõn đoạn dịch chiết từ lỏ dõu tằm cho kết quả phản ứng với cỏc thuốc thử trờn. Đỏng chỳ ý là phản ứng định tớnh flavonoid, glycoside, tannin cho kết quả khỏ rừ. Kết quả định tớnh cho thấy ethanol là một dung mụi tỏch chiết tốt nhất đối với cỏc hợp chất tự
Nhúm chất Phản ứng nhận biết Lỏ cõy Dõu tằm
EtOH N-hex EtOAc
Flavonoid Shinoda ++ + + Diazo ++ + ++ NaOH 10% + + + H2SO4 ++ + + Tannin Vanillin - - - FeCl3/HCl ++ ++ +++ Gelatin + - - Alkaloid Dragendorf + + - Bouchardat - + - Glycoside Keller-Kilian ++ ++ ++ Saponin Tạo bọt - - -
nhiờn, tiếp đú là đến phõn đoạn n-hexan và cuối cựng là phõn đoạn
ethylaxetate.
3.1.3. Phõn tớch thành phần cỏc hợp chất tự nhiờn trong dịch chiết lỏ Dõu tằm bằng sắc kớ lớp mỏng tằm bằng sắc kớ lớp mỏng
Chỳng tụi đó tiến hành chạy sắc kớ bản mỏng trỏng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung mụi khỏc nhau. ua thăm dũ cho thấy hệ dung mụi TEAF (5:3:1:1) (Toluen-Ethylacetate-Acetone-acid Formic) là cho kết quả rừ nột nhất và được chỳng tụi lựa chọn.
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ cỏc ph n đoạn
Kết quả sắc ký đồ hỡnh 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch cú màu sắc khỏc nhau.
Qua quan sỏt trờn sắc ký đồ, chỳng tụi nhận thấy kết quả sắc ký đồ của cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ Dõu tằm xuất hiện khỏ nhiều vạch màu vàng (cỏc hợp chất thuộc nhúm flavonoid), màu xanh (diệp lục), màu tớm (tecpen). Trờn sắc kớ đồ cho thấy phõn đoạn cao ethanol xuất hiện nhiều băng vạch nhất khoảng 14 – 15 băng vạch, tiếp đến là phõn đoạn n-hexan khoảng 12 vạch.
Chỳ thớch: 1: Cao EtOH
2: Cao n-hexan 3: Cao EtOAc
Như vậy ở loài thực vật nghiờn cứu, phõn đoạn ethanol cú chứa nhiều nhúm hợp chất flavonoid nhất.
3.1.4. Định lượng polyphenol tổng số trong cỏc phõn đ ạn dịch chiết
Chỳng tụi tiến hành xỏc định hàm lượng polyphenol tổng số trong cỏc phõn đoạn dịch chiết bằng phương phỏp Folin- Ciocalteau. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả hàm lượng polyphenol tổng số tr ng cỏc PĐ dịch chiết
Mẫu PĐ Dịch lỏ cõy dõu tằm OD765nm Hàm lượng polyphenol(mg/l) Tỷ lệ (%) EtOH 0.59 577.2 5.772 n-hexan 0.5 487.2 4.872 EtOAc 0.06 47.2 0.472
Kết quả bảng 3.3 cho thấy hàm lượng polyphenol trong phõn đoạn cao EtOH là nhiều nhất chiếm 5.772 , tiếp đú là phõn đoạn n- hexan (chiếm 4.872 ). Phõn đoạn EtOAc cú hàm lượng hợp chất này thấp là 0.472%.
3.2. Kết quả xỏc định liều độc cấp
Xỏc định LD50 của dịch chiết từ lỏ cõy dõu tằm trờn chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương phỏp của Lorke. Chuột cho nhịn đúi trước 16 giờ thớ nghiệm, được phõn lụ ngẫu nhiờn, mỗi lụ gồm 10 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dừi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đỏnh giỏ mức độ độc của dịch chiết.
Sau 72 giờ theo dừi với cỏc liều lượng khỏc nhau, khụng thấy cú con chuột nào chết. Vỡ vậy chưa tớnh được LD50 theo đường uống. Điều đú chứng tỏ, cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm hoàn toàn khụng độc dự là liều rất cao theo đường uống. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Kết quả thử độc tớnh cấp the đường uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0
7000mg/kg 10 0 0
7500mg/kg 10 0 0
8000mg/kg 10 0 0
3.3. Kết quả xõy dựng mụ hỡnh chuột bộo phỡ thực nghiệm.
Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 - 16g) được chia làm 8 lụ.
Lụ 1: cho ăn chế độ bỡnh thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lụ 2 - 8: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao.
Sau 8 tuần nuụi theo chế độ trờn, chỳng tụi tiến hành cõn trọng lượng chuột.
Hỡnh 3.3. Chuột bộo phỡ (A) và chuột nuụi thường (B)
Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thớ nghiệm được thể hiện ở bảng 3.5 và hỡnh 3.4.
B
Bảng 3.5. Trọng lượng trung nh của hai nhúm chuột nuụi ằng hai chế độ dinh dưỡng khỏc nhau.
(Số liệu thể hiện trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của cỏc lụ chuột; (*): p < 0.05 so sỏnh với nhúm ăn thường)
Hỡnh 3.4. Biểu đồ iểu diễn sự tăng trọng của cỏc nhúm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khỏc nhau tr ng vũng 8 tuần.
Bảng 3.5 và hỡnh 3.4 đó cho thấy rằng chuột được nuụi theo chế độ ăn cú hàm lượng lipid và cholesterol cao cú khả năng tăng về trọng lượng lớn
Nhúm chuột
Trọng lượng trung bỡnh của chuột tại cỏc thời điểm khỏc nhau (g) Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Nhúm ăn thường 15.67 19.05 23.46 27.23 29.17 31.34 34.52 37.03 40.31 ±1.07 ±0.50 ±0.65 ±0.45 ±0.50 ±0.75 ±0.84 ±1.25 ±1.54 Nhúm ăn bộo 15.35 21.08 28.76 35.89 41.17 46.43 49.57 53.38 57.96 ±1.20 ±1.52 ±1.57 ±2.31 ±2.46 ±2,05 ±2.70 ±2.38 ±2.94 (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*)
hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khỏc này là cú ý nghĩa thống kờ với trị số p < 0.05. Cụ thể là:
Tại thời điểm ban đấu sự khỏc nhau về trọng lượng khụng cú ý ngĩa thống kờ (p> 0.05).
Sau 8 tuần nuụi, chuột nuụi với chế độ ăn thường trọng lượng cơ thể chỉ tăng thờm 24,64g tương ứng tăng lờn 157,24 so với ban đầu, trong khi nhúm chuột ăn b o trọng lượng cơ thể tăng thờm 42,61g ứng với 277,58% so với ban đầu. Như vậy, nhúm chuột ăn b o đó tăng trọng lượng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 17,97g hay gấp 1.73 lần. Đõy là một kết quả khả quan, phự hợp với thực nghiệm nuụi bộo chuột của TS. Phựng Thanh Hương [8].
Để đỏnh giỏ ảnh hưởng của chế độ nuụi b o đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cựng của thời gian nuụi bộo sau khi cho nhịn đúi qua đờm, chỳng tụi lựa chọn ngẫu nhiờn 10 con chuột, lấy mỏu tổng số và phõn tớch một số chỉ số hoỏ sinh. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.6 và hỡnh 3.5 sau đõy.
Bảng 3.6. So sỏnh một số chỉ số húa sinh mỏu giữa chuột nuụi thường và nuụi bộo phỡ thực nghiệm.
Nhúm Cỏc chỉ số lipid (mmol/l) Glucose
(mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Nhúm ăn thường 4.16 1.42 1.63 1.15 6.72 ±0.12 ±0.13 ±0.10 ±0.14 ±0.45 Nhúm ăn 5.37* 2.20* 0.72* 1.74* 7.95* ±0.24 ±0.17 ±0.05 ±0.13 ±0.37 So sỏnh lụ bộo / thường ↑1.29 Lần ↑1.55 Lần ↓0.44 Lần ↑1.51 Lần ↑1.18 Lần
(Số liệu thể hiện trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của 10 con chuột; (*): p < 0.05 khi so sỏnh với nhúm ăn thường)
Hỡnh 3.5. Biểu đồ so sỏnh một số chỉ số húa sinh giữa cỏc lụ chuột TNo.
Kết quả ở bảng 3.6 và hỡnh 3.5 cho thấy cỏc chỉ số húa sinh đó cú sự khỏc biệt giữa lụ chuột nuụi thường và lụ chuột nuụi bộo. Cụ thể:
Sau 8 tuần, nhúm chuột cho ăn thức ăn b o cú hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c trong huyết thanh đều cao hơn với khoảng tin cậy > 95% (p<0.05) so với nhúm ăn bằng thức ăn thường. Hàm lượng cholesterol toàn phần / triglyceride / LDL-c/ Glucose trong huyết thanh của nhúm chuột nuụi b o tương ứng tăng gấp 1.29 / 1.55 / 1.51/ 1.18 lần so với nhúm chuột nuụi bằng thức ăn thường. Tuy nhiờn, hàm lượng HDL –c lại cú sụt giảm mạnh, chuột nuụi thức ăn b o (0.72 mmol/l) giảm 0.44 lần so với chuột nuụi thường (1.63 mmol/l), với P < 0.05.
Kết quả này hoàn toàn phự hợp thực tế và với kết quả nghiờn cứu của Srinivasan và cộng sự [13]. Như vậy, với chế độ nuụi b o đó gõy rối loạn trao đổi lipid và glucid ở chuột.
Kết quả trờn cú thể giải thớch là do bỡnh thường 70% tới 75% cholesterol được tạo ra bởi gan; cũn lại 20% đến 25% do cỏc loại chất bộo từ thức ăn cú mỡ động vật và thực vật mang vào cơ thể nhưng khi chuột được ăn
thức ăn cú thành phần giàu lipid (32%) và cholesterol (1%) hay hàm lượng chất bộo quỏ nhiều, gan khụng thể chuyển húa hết được sẽ tạo ra nhiều VLDL và biến thành LDL. Và nếu khụng đủ HDL để mang chất mỡ xấu LDL đi thỡ đương nhiờn hàm lượng của triglyceride và cholesterol toàn phần trong mỏu tăng, sự tăng ở đõy chủ yếu là do thu nhận từ quỏ trỡnh tiờu hoỏ.
TG – Triglyxeride hay mỡ trung tớnh là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật. Tế bào của mụ hấp thụ triglycerid và tiờu dựng theo nhu cầu, khi dư thừa nú tớch tụ trong tế bào và trở thành dạng năng lượng dự trữ trong cỏc mụ mỡ nờn phần lớn chất b o trong cơ thể được dự trữ dưới dạng Triglyxerid để dựng tạo năng lượng. Trong thời gian dài chuột luụn cú chế độ ăn dư thừa triglycerid nờn khụng những trọng lượng tăng mà hàm lượng triglycerid trong mỏu cũng ứ đọng rất cao. Đỏng chỳ ý là sự biến thiờn hai chỉ số HDL-c và LDL-c. HDL-c và LDL-c là hai dạng lipoprotein cú thành phần giàu cholesterol (lần lượt chứa 18% và ~ 70%) tham gia vào quỏ trỡnh trao đổi cholesterol của cơ thể theo hai chiều ngược nhau. LDL – c, cú tỷ trọng thấp là một loại chất bộo tệ hại nhất, gọi là mỡ xấu. Tỏc dụng của LDL – c là mang chất mỡ từ gan đến khắp cơ thể và bỏm vào thành động mạch làm nú h p lại hay đõy là tỏc nhõn gõy xơ vữa và làm tắc nghẽn động mạch ở người bộo phỡ, dễ gõy nhồi mỏu cơ tim và đột tử khi gõy tắc mạch mỏu nóo. HDL – c, cũn gọi là mỡ tốt, cú nhiệm vụ chuyờn trở cỏc chất mỡ dư thừa từ tế bào ngoại vi mang trở lại gan và được thải qua đường mật, HDL ngăn cản mỡ xấu LDL bỏm vào thành động mạch.
Như vậy cú thể kết luận mụ hỡnh gõy chuột bộo phỡ bằng cỏc chế độ ăn giàu chất b o đó thành cụng. Chuột b o phỡ được tiếp tục sử dụng cho những nghiờn cứu tiếp theo.
3.4. Tỏc dụng hạ gluc se huyết của dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm trờn mụ h nh chuột ĐTĐ type 2.
3.4.1. Kết quả tạo mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm.