Dựa vào tỏc dụng và cơ chế tỏc dụng, cỏc thuốc điều trị bệnh ĐTĐ được chia thành cỏc nhúm chớnh:
- Cỏc thuốc giảm đường huyết - Insulin
- Glucosidase Inhibitors - Thiazolidinediones - Tainsulin
1.3.6. Đỏi thỏ đường với y học cổ truyền
Theo Đụng Y, bệnh ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiờu khỏt, với ba triệu chứng chủ yếu là ăn nhiều, uống nhiều và tiểu nhiều. Do ăn nhiều cỏc chất cay, bộo ngọt làm mất cõn bằng õm dương trong cơ thể, tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt, làm phần õm của phủ tạng như õm, vị thận bị hao tổn. Hỏa nhiệt làm phế hư gõy chứng tiờu khỏt, vị õm gõy chứng gầy đúi, thận õm hư gõy tiểu nhiều và tiểu ra đường. Xuất phỏt từ quan niệm trờn, nờn phương phỏp
điều trị chủ yếu là dưỡng õm, thanh nhiệt sinh tõn dịch làm cơ sở để lập lại cõn bằng õm dương trong cơ thể.
Việt Nam là nước cú nguồn dược liệu rất phong phỳ. Bờn cạnh chế độ ăn uống và tập luyện hợp lý thỡ việc sử dụng thảo mộc trong điều trị bệnh ĐTĐ từ lõu đó được biết đến với nhiều tỏc dụng tớch cực. Cỏc thuốc điều trị bệnh ĐTĐ của Đụng Y chủ yếu là cỏc thuốc cú nguồn gốc từ dược liệu. Một số thảo mộc rất sẵn trong nước cú tỏc dụng hỗ trợ điều trị bệnh ĐTĐ như: Bầu đắng, tỏi, nghệ, quế, hành tõy, bớ đao, mướp đắng, khế, rau muống, cõy dõu [12]…
1.4. Mối quan hệ giữa ph và đỏi thỏ đường
BP và ĐTĐ là hai bệnh khụng truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỉ 21. Hai căn bệnh này cú mối liờn quan ch t chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người BP luụn tăng tương đương với số bệnh nhõn bị ĐTĐ. Một cuộc khảo sỏt của Mỹ gần đõy đó chỉ ra rằng cú tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do BP. BP liờn quan tới ĐTĐ type 2 thụng qua sự đề khỏng insulin.
Kết quả của nhiều nghiờn cứu cho thấy acid bộo tự do cú vai trũ trong bệnh sinh ĐTĐ type 2. Phần lớn người BP cú nồng độ acid bộo trong huyết tương tăng cao. Sự tăng này ức chế quỏ trỡnh hấp thu glucose ngoại vi dưới tỏc dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose.
Cú nhiều nhõn tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa BP và bệnh ĐTĐ type 2 bao gồm: chỉ số khối cơ thể, thời gian BP, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thõn thể. Một thống kờ đó chỉ rằng những người cú chỉ số khối cơ thể lớn hơn 30kg/m2 trong 10 năm cú nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị BP dưới 5 năm và nếu trọng lượng cơ thể tăng một kilogram thỡ rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4.5 [10]. Kết quả của nhiều nghiờn cứu cho thấy acid bộo tự do cú vai trũ trong bệnh sinh ĐTĐ type 2. Phần lớn người BP cú nồng độ acid bộo trong huyết tương tăng cao. Sự tăng này ức chế quỏ trỡnh
hấp thu glucose ngoại vi dưới tỏc dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy húa glucose ở cơ.
Nhiều nghiờn cứu trờn thế giới đó thấy rằng thừa cõn và BP cú một mối liờn quan ch t chẽ đến tớnh khỏng insulin và bệnh ĐTĐ type 2 và điều đú cũng khụng loại trừ ở cỏc bệnh nhõn ĐTĐ Việt Nam. ĐTĐ đ c trưng bởi sự rối loạn chuyển húa glucid, sự rối loạn này ảnh hưởng đến mụi trường nội mụi do đú k o theo ho c làm quỏ trỡnh rối loạn chuyển húa lipit ở mỗi loại ĐTĐ mang những đ c trưng riờng. Đ c trưng chung của rối loạn chuyển húa lipit trong ĐTĐ là sự tăng triglyceride, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bỡnh thường. Tuy nhiờn ở ĐTĐ type1 rối loạn tăng triglyceride sẽ mất đi khiểm soỏt được glucose mỏu khỏc với type 2, rối loạn này cú thể vẫn kộo dài m c dự cú sự điều trị giảm glucose mỏu thớch hợp. LDL-c của type2 cũng cú thể tăng nh và xuất hiện nhiều LDL-c với kớch thước nhỏ và n ng hơn khi việc kiểm soỏt glucose k m. Đõy chớnh là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vỡ động mạch [10].
1.5.Vài nột chung về cõy Dõu tằm (Morus alba L.)1.5.1. Đặc điểm sinh học 1.5.1. Đặc điểm sinh học
Dõu tằm (Morus alba L.) hay cũn gọi là dõu ta, dõu trắng, dõu cang thuộc họ Dõu tằm (Moracaae) là một loài cõy gỗ từ nhỏ đến nhỡ, lớn nhanh, cú thể cao tới 15-20 m. Cõy gỗ nhỏ, cao khoảng 3m. Cành mềm, lỳc non cú lụng, sau nhẵn và cú màu xỏm trắng, chồi nỏch nhỏ màu nõu vàng. Vỏ thõn cú nốt sần, cú mủ trắng như sữa. Lỏ mọc so le, hỡnh bầu dục, hỡnh tim ho c hỡnh trứng rộng, cú mũi nhọn ở đầu, phiến mỏng, mềm, dài 5-10 (15) cm, rộng 4-8 (10) cm, m p cú răng cưa đều, phiến nguyờn hay đụi khi chia 3-5 thựy trờn cỏc nhỏnh cũn non, 3 gõn ở gốc, cỏc gõn bờn đạt tới chiều dài của phiến, đụi gõn bờn tận cựng ở ẵ chiều dài phiến lỏ. M t trờn của lỏ màu lục sẫm hay lục xỏm, m t dưới màu lục nhạt hơn, nổi rừ cỏc gõn lớn chạy từ cuống lỏ và nhiều
gõn nhỏ hỡnh mạng lưới, cú lụng tơ mịn rải rỏc trờn gõn lỏ. Cuống dài 2-4 cm, mảnh, cú lụng thưa. Lỏ hàng năm rụng vào mựa đụng. Lỏ kốm cũn non hỡnh tam giỏc nhọn, khi già xoắn lại thành hỡnh dải đầu nhọn [13].
Cõy Dõu tằm(Morus alba L.) tại Việt Nam gọi đơn giản là cõy dõu, hay cõy dõu trắng cú nguồn gốc ở khu vực phớa Đụng Chõu Á. Cõy dõu ưa khớ hậu mỏt và kho nờn mọc được ở nhiều vựng đất, mọc nhiều ở vựng nhiệt đới, cũn vựng ụn đới thỡ mọc vào mựa hố.
1.5.2. Thành phần húa học
Lỏ dõu tằm chứa cỏc thành phần bay hơi như tinh dầu (0,0035%), cỏc thành phần khụng bay hơi gồm protein, carbohydrat, flavonoid, coumarin, vitamin…Cỏc flavonoid: rutin, quercetin, moracetin (quercetin-3-triglucosid), quercitrin (quercetin 3- rhamnosid), isoquercitrin (quercetin-3- glucosid). Cỏc dẫn chất coumarin: umbeliferon, scopoletin, scopolin. Cỏc vitamin B, C, D, caroten. Cỏc sterol: β-sitosterol, campesterol, β-sitosterol glycosid, β- ecdyson và inokosterol. Cỏc acid hữu cơ: oxalic, malic, tartric, citric, fumaric, palmitic và ester ethyl palmitat [1].
1.5.3. Một số tỏc dụng Sinh - dược và cụng dụng của lỏ cõy Dõu tằm.
Lỏ cõy Dõu tằm (Đụng y gọi là Tang diệp) cú vị đắng ngọt, tớnh hàn, cú cụng hiệu mỏt gan sỏng mắt, thư phong tỏn nhiệt, lợi ngũ tạng, thụng khớp xương, làm mượt túc, dưỡng tõn dịch, dựng chữa cảm sốt, ho, đau đầu, chúng m t, đau sưng họng, mắt đau sưng đỏ, xuất huyết do chấn thương, rết cắn, chõn phự [3].
Trong Đụng y, lỏ dõu cú một phạm vi ứng dụng lõm sàng rộng rói. Người Trung Quốc đó sử dụng lỏ dõu tằm trong cỏc bài thuốc Đụng y từ rất lõu, trước khi y học cú được bảng phõn thớch thành phần. Lỏ dõu tằm hóm lấy nước uống để chống mệt mỏi, suy nhược, mất ngủ, suy giảm miễn dịch, hỗ trợ hạ đường huyết. Dõu tằm cũn chứa nhiều sắt, rất tốt cho những người thiếu mỏu do sắt và phụ nữ mang thai. Một số thực nghiệm lõm sàng cho thấy ăn lỏ dõu hằng ngày (canh lỏ dõu, canh hến lỏ dõu ho c xào với trứng) ho c nước hóm lỏ dõu cú khả năng ổn định huyết ỏp, nhịp tim, đường huyết, làm giảm đỏng kể nguy cơ đột quỵ ở nhúm người tăng huyết ỏp và biến chứng ở người tiểu đường.
Tỏc dụng chữa bệnh: lỏ dõu (tang diệp) cú tỏc dụng hạ sốt, chữa cảm mạo, hạ huyết ỏp, làm sỏng mắt, chữa chứng mồ hụi trộm ở tr nhỏ, chứng thổ huyết, làm lành vết thương [1],[3].
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tượng nghiờn cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
+ Lỏ cõy Dõu tằm (Morus alba L.)
+ Bộ phận sử dụng: lỏ
+ Địa điểm, thời gian thu mẫu: Lỏ Dõu tằm được thu vào thỏng 8 năm 2012 tại huyện Súc Sơn – Hà Nội.
Hỡnh 2.1. Cõy Dõu tằm (Morus alba L.)
2.1.2. Mẫu động vật
Chuột bạch chủng Swiss n ng từ 14 - 16g được nuụi BP và gõy ĐTĐ type 2 do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
2.1.3. Húa chất và dụng cụ thớ nghiệm
* STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse.
* Ethanol 900, Húa chất dựng cho quỏ trỡnh tỏch chiết, định tớnh, định lượng như n-hexan, ethylacetate…
* Mỏy đo đường huyết tự động One Touch Ultra.
* Bộ kớt thử Medisense optium blood glucose electrodes.
* Cõn phõn tớch, mỏy ly tõm, lũ vi súng, mỏy lắc vontex, pipetman… Cỏc thiết bị đều đảm bảo tiờu chuẩn về độ chớnh xỏc và an toàn.
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Phương phỏp tỏch chiết mẫu nghiờn cứu
Chiết cao tổng số: Dựng 3kg bột mẫu thực vật khụ được chiết 3 lần với
ethanol 80%. Sau khi cho dung mụi chiết vào mẫu (tỉ lệ mẫu : dung mụi = 1:3), khuấy đều và tiến hành siờu õm trong lạnh với tần suất 15Hz/30 phỳt và tiếp tục được ngõm trong vũng 1 tuần cú lắc liờn tục. Sau đú tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.1, gom cỏc dịch lọc, thu loại dung mụi trờn mỏy cụ chõn khụng ở 30 – 400C thu được cao tổng số.
Chiết ph n đoạn cỏc hợp chất tự nhiờn: Hũa tan cao tổng số trong một
thể tớch tối thiểu nước ấm cho tới khi tan hoàn toàn, sau đú tiến hành chiết phõn đoạn qua cỏc dung mụi với độ phõn cực tăng dần: n- hexan; ethylaxetat. Mỗi phõn đoạn được chiết 3 lần và tớnh kết quả trung bỡnh. Khối lượng cỏc phõn đoạn dịch chiết trong cỏc thớ nghiệm được tớnh giỏn tiếp từ thành phần phần trăm của mẫu khụ tuyệt đối.
2.2.2. Phương phỏp khảo sỏt thành phần húa học của cõy Dõu tằm
(Morus alba L.)
2.2.2.1. Định tớnh một số nhúm hợp chất tự nhiờn
Cao cỏc phõn đoạn được hũa tan trong dung mụi thớch hợp với từng loại phản ứng định tớnh [6]. Cỏc nhúm phản ứng được trỡnh bày túm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng cỏc phản ứng định tớnh đặc trưng
Nhúm hợp
chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCL
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự cú m t của flavon, flavonol và cỏc dẫn xuất hydro của chỳng
Diazo húa Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tớnh
Dung dịch
kiềm NaOH 10%
Phản ứng cú kết quả dương tớnh khi xuất hiện màu vàng cam
Acid sulfuric H2SO4 10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự cú m t của favon và flavonol, màu đỏ hay nõu cho thấy sự cú m t của chalcon và auron
Vanilin/HCL Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự cú m t của catechin.
Tannin
Vaninlin/H2SO4
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5%, Gelatin/1% NaCL
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chỡ 10% Phản ứng dương tớnh nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid Bouchardat Hỗn hợp KI+I2/HCL
Phản ứng dương tớnh nếu cú màu đỏ thẫm
vansMayer Hỗn hợp HgCL2+ KI
Phản ứng dương tớnh nếu cú kết tủa màu trắng ho c vàng nhạt. Dragendorf Phản ứng dương tớnh nếu cú kết
tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện vũng đỏ nõu ở bề m t phõn cỏch giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khỏc
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu vàng.
FeCL3/HCL Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số the phương phỏp F lin Ciocalteau
Nguyờn tắc: dựa trờn phản ứng của cỏc hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trờn mỏy quang phổ UV VIS 1000 ở bước súng λ = 765 nm, dựng chất chuẩn là acid gallic .
Cỏc bước tiến hành như sau:
* Chuẩn bị mẫu định lượng và húa chất.
Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic cú nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3; 200g Na2CO3+800ml H2O đun sụi. Thờm một vài giọt tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
* Tiến hành xõy dựng đường chuẩn acid gallic.
Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và 10ml sau đú dẫn nước cất tới 100ml ta thu được cỏc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, và 500mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 àl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở cỏc nồng độ ho c dịch chiết cỏc phõn đoạn ) + 1.58 ml H2O + 100 àlthuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giõy đến 8 phỳt cho thờm 300 àl Na2CO3. Để hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 200c rồi xỏc định ở bước súng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
* Kết quả xõy dựng đường chuẩnacid gallic
Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn gallic
STT Acid gallic (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hỡnh2.3. Đồ thị chuẩn acid gallic
Đ? th? chu?n acid gallic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg Acid gallic O D 7 65 n m y = 0.001x + 0.0128
Định lượng polyphenol tổng số:
Cõn 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phõn đoạn dịch chiết hũa tan trong 1 ml ethanol 90%, bổ sung thờm nước cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu được dung dịch gốc cú nồng độ chất tan là 10.000 mg/l. Lấy 1 ml dung dịch gốc hũa với 9 ml nước cất thu được dung dịch cao cú nồng độ 1000 mg/l.
Tiến hành thớ nghiệm tương tự như đối với dung dịch acid gallic, xỏc định giỏ trị OD, từ đú tớnh nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khối lượng polyphenol trong mỗi phõn đoạn dịch chiết.
Theo đú:
Hàm lượng polyphenol trong dung dịch = 1000 (OD – 0,0128) (mg/l)
2.2.3. Nghiờn cứu tỏc dụng của dịch chiết cỏc phõn đ ạn lỏ cõy Dõu tằm lờn trọng lượng và một số chỉ số húa sinh mỏu của chuột BP thực nghiệm 2.2.3.1. Xõy dựng mụ hỡnh chuột BP thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm súc bỡnh thường trong 3-4 ngày để thớch ứng với mụi trường mới sau đú tiến hành phõn chuột thành 2 nhúm với hai chế độ dinh dưỡng như sau [17]:
Nhúm 1 - Nhúm đối chứng: Cỏc con chuột tiếp tục được chăm súc bằng thức ăn bỡnh thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp).
Nhúm 2 - Nhúm nuụi bộo: Cỏc con chuột được chăm súc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol.
Bảng 2.3. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 41 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 1 Chất khoỏng 4
Cỏc nhúm chuột được theo dừi trong vũng 8 tuần, trọng lượng của cỏc con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cựng thời gian thớ nghiệm, sau khi xỏc định trọng lượng, chỳng tụi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiờn từ mỗi nhúm ra 10 con chuột, lấy mỏu tổng số và phõn tớch một số chỉ số lipid mỏu. Cỏc số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kờ.
2.2.3.2. Thử độc tớnh cấp, xỏc định LD50
Xỏc định độc tớnh cấp với liều lượng húa chất gõy chết cho 50 động vật thử nghiệm (LD50) của dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm theo phương phỏp Lorke [16]. Chuột nhịn đúi trước 16 giờ làm thớ nghiệm, được phõn lụ ngẫu nhiờn N=10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (liều tối đa cho ph p). Theo dừi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đỏnh giỏ mức độ độc của dịch chiết.
2.2.4. Nghiờn cứu tỏc dụng hạ đường huyết của dịch chiết lỏ cõy dõu tằm lờn chuột nhắt gõy ĐTĐ ằng STZ lờn chuột nhắt gõy ĐTĐ ằng STZ
Để tỡm hiểu tỏc dụng hạ đường huyết của dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm trước tiờn chỳng tụi tiến hành gõy mụ hỡnh chuột ĐTĐ mụ phỏng type 2 dựa trờn chế độ ăn giàu chất bộo kết hợp với STZ liều thấp [17], [18].
2.2.4.1. Phương phỏp gõy ĐTĐ thực nghiệm mụ phỏng type 2
Chuột nuụi BP được gõy ĐTĐ type 2 bằng tiờm STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0.01M, pH = 4.3) dưới màng bụng, gõy rối loạn trao đổi glucose mỏu của chuột BP thực nghiệm nhằm tạo mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2 phỏt triển từ BP. Trước khi thớ nghiệm cho chuột nhịn đúi 16h. Sau đú chỳng