(Morus alba L.)
2.2.2.1. Định tớnh một số nhúm hợp chất tự nhiờn
Cao cỏc phõn đoạn được hũa tan trong dung mụi thớch hợp với từng loại phản ứng định tớnh [6]. Cỏc nhúm phản ứng được trỡnh bày túm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng cỏc phản ứng định tớnh đặc trưng
Nhúm hợp
chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCL
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự cú m t của flavon, flavonol và cỏc dẫn xuất hydro của chỳng
Diazo húa Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tớnh
Dung dịch
kiềm NaOH 10%
Phản ứng cú kết quả dương tớnh khi xuất hiện màu vàng cam
Acid sulfuric H2SO4 10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự cú m t của favon và flavonol, màu đỏ hay nõu cho thấy sự cú m t của chalcon và auron
Vanilin/HCL Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự cú m t của catechin.
Tannin
Vaninlin/H2SO4
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5%, Gelatin/1% NaCL
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chỡ 10% Phản ứng dương tớnh nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid Bouchardat Hỗn hợp KI+I2/HCL
Phản ứng dương tớnh nếu cú màu đỏ thẫm
vansMayer Hỗn hợp HgCL2+ KI
Phản ứng dương tớnh nếu cú kết tủa màu trắng ho c vàng nhạt. Dragendorf Phản ứng dương tớnh nếu cú kết
tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện vũng đỏ nõu ở bề m t phõn cỏch giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khỏc
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu vàng.
FeCL3/HCL Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số the phương phỏp F lin Ciocalteau
Nguyờn tắc: dựa trờn phản ứng của cỏc hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trờn mỏy quang phổ UV VIS 1000 ở bước súng λ = 765 nm, dựng chất chuẩn là acid gallic .
Cỏc bước tiến hành như sau:
* Chuẩn bị mẫu định lượng và húa chất.
Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic cú nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3; 200g Na2CO3+800ml H2O đun sụi. Thờm một vài giọt tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
* Tiến hành xõy dựng đường chuẩn acid gallic.
Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và 10ml sau đú dẫn nước cất tới 100ml ta thu được cỏc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, và 500mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 àl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở cỏc nồng độ ho c dịch chiết cỏc phõn đoạn ) + 1.58 ml H2O + 100 àlthuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giõy đến 8 phỳt cho thờm 300 àl Na2CO3. Để hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 200c rồi xỏc định ở bước súng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
* Kết quả xõy dựng đường chuẩnacid gallic
Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn gallic
STT Acid gallic (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hỡnh2.3. Đồ thị chuẩn acid gallic
Đ? th? chu?n acid gallic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg Acid gallic O D 7 65 n m y = 0.001x + 0.0128
Định lượng polyphenol tổng số:
Cõn 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phõn đoạn dịch chiết hũa tan trong 1 ml ethanol 90%, bổ sung thờm nước cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu được dung dịch gốc cú nồng độ chất tan là 10.000 mg/l. Lấy 1 ml dung dịch gốc hũa với 9 ml nước cất thu được dung dịch cao cú nồng độ 1000 mg/l.
Tiến hành thớ nghiệm tương tự như đối với dung dịch acid gallic, xỏc định giỏ trị OD, từ đú tớnh nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khối lượng polyphenol trong mỗi phõn đoạn dịch chiết.
Theo đú:
Hàm lượng polyphenol trong dung dịch = 1000 (OD – 0,0128) (mg/l)
2.2.3. Nghiờn cứu tỏc dụng của dịch chiết cỏc phõn đ ạn lỏ cõy Dõu tằm lờn trọng lượng và một số chỉ số húa sinh mỏu của chuột BP thực nghiệm 2.2.3.1. Xõy dựng mụ hỡnh chuột BP thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm súc bỡnh thường trong 3-4 ngày để thớch ứng với mụi trường mới sau đú tiến hành phõn chuột thành 2 nhúm với hai chế độ dinh dưỡng như sau [17]:
Nhúm 1 - Nhúm đối chứng: Cỏc con chuột tiếp tục được chăm súc bằng thức ăn bỡnh thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp).
Nhúm 2 - Nhúm nuụi bộo: Cỏc con chuột được chăm súc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol.
Bảng 2.3. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 41 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 1 Chất khoỏng 4
Cỏc nhúm chuột được theo dừi trong vũng 8 tuần, trọng lượng của cỏc con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cựng thời gian thớ nghiệm, sau khi xỏc định trọng lượng, chỳng tụi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiờn từ mỗi nhúm ra 10 con chuột, lấy mỏu tổng số và phõn tớch một số chỉ số lipid mỏu. Cỏc số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kờ.
2.2.3.2. Thử độc tớnh cấp, xỏc định LD50
Xỏc định độc tớnh cấp với liều lượng húa chất gõy chết cho 50 động vật thử nghiệm (LD50) của dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm theo phương phỏp Lorke [16]. Chuột nhịn đúi trước 16 giờ làm thớ nghiệm, được phõn lụ ngẫu nhiờn N=10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (liều tối đa cho ph p). Theo dừi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đỏnh giỏ mức độ độc của dịch chiết.
2.2.4. Nghiờn cứu tỏc dụng hạ đường huyết của dịch chiết lỏ cõy dõu tằm lờn chuột nhắt gõy ĐTĐ ằng STZ lờn chuột nhắt gõy ĐTĐ ằng STZ
Để tỡm hiểu tỏc dụng hạ đường huyết của dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm trước tiờn chỳng tụi tiến hành gõy mụ hỡnh chuột ĐTĐ mụ phỏng type 2 dựa trờn chế độ ăn giàu chất bộo kết hợp với STZ liều thấp [17], [18].
2.2.4.1. Phương phỏp gõy ĐTĐ thực nghiệm mụ phỏng type 2
Chuột nuụi BP được gõy ĐTĐ type 2 bằng tiờm STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0.01M, pH = 4.3) dưới màng bụng, gõy rối loạn trao đổi glucose mỏu của chuột BP thực nghiệm nhằm tạo mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2 phỏt triển từ BP. Trước khi thớ nghiệm cho chuột nhịn đúi 16h. Sau đú chỳng được uống nước và ăn bỡnh thường. Sau từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xỏc định ≥ 18 mmol/l. Tiến hành phõn cỏc lụ chuột (mỗi lụ gồm 5 con) đó bị bệnh để nghiờn cứu khả năng hạ đường huyết khi sử dụng cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm.
Lụ 2: Lụ STZ điều trị bằng phõn đoạn EtOH Lụ 3: Lụ STZ điều trị bằng phõn đoạn n-hexan Lụ 4: Lụ STZ điều trị bằng phõn đoạn EtOAc
Chuột bị bệnh uống điều trị cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở cỏc thời điểm khỏc nhau và tiến hành cỏc xột nghiệm tiếp theo. Sau đú tiếp tục điều trị cho chuột trong vũng 21 ngày (3 tuần).
2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm trờn mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2
Cỏc lụ chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lụ) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cỏch cho uống phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm với liều 2000mg/kg. Đường huyết của cỏc con chuột được đo vào cựng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đúi 12 giờ ở cỏc ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị.
Bảng 2.4. Mụ hỡnh nghiờn cứu khả năng hạ glucose của cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm
Lụ Chế độ ăn
Trước điều trị Tiờm Mục đớch
1 Thức ăn chuẩn Uống nước cất, khụng điều trị. 2 Thức ăn b o STZ Uống nước cất, khụng điều trị.
3 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phõn đoạn ethanol (2000mg/kg) 4 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phõn đoạn n-hexan (2000mg/kg 5 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phõn đoạn ethylacetate (2000mg/kg)
2.2.5. Sử dụng phương phỏp húa sinh - y dược 2.2.5.1. Phương phỏp định lượng glucose huyết 2.2.5.1. Phương phỏp định lượng glucose huyết
* Nguyờn tắc:
Nguyờn tắc hoạt động của phương phỏp dựa trờn chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương phỏp quang học để định lượng glucose huyết.
+ Phản ứng 1: Khi mỏu tiếp xỳc với bề m t của vựng phản ứng que thử, dưới xỳc tỏc đ c hiệu của glucose oxidase (GOD) cú trong kớt thử, glucose trong mỏu phản ứng với oxy (khụng khớ) tạo thành axit gluconic và hydro peroxide (H2O2).
+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong mỏy One Touch Ultra chuyển húa định lượng biểu thị bằng số mmol/L ho c mg/dl glucose.
* Tiến hành: Ấn nỳt điều khiển để khởi động mỏy. Gắn que thử vào mỏy. Dựng kim chõm chuyờn dụng chõm vào mạch mỏu ở đuụi chuột, để mỏu chảy tự nhiờn, thấm bỏ giọt đầu tiờn, lấy giọt mỏu thứ 2. Mẫu mỏu dựng cho việc đo là 1àL, phải là giọt mỏu trũn đầy, phủ kớn giọt mỏu lờn vựng phản ứng của que thử. Sau 5 giõy, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trờn màn hỡnh.
2.2.5.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh
Cỏc chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xỏc định trờn mỏy xột nghiệm sinh húa tự động (Phũng húa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xụ). Nguyờn tắc xỏc định của mỗi chỉ số như sau:
a) Định ượng triglycerid
Thuỷ phõn triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phúng ra bằng phương phỏp đo màu của quynonimin tạo thành từ
4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo cỏc phản ứng sau:
Triglycerid Glycerol + acid bộo
Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihidroxyacetone + H2O2
H2O2 + Aminoantipyrine + 4- chlorophenol Quynonimin + 4HCl + 4H2O
Đo mật độ quang học quynonimin ở bước súng 546nm (mỏy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tớnh kết quả.
b) Định ượng cholesterol toàn phần
Thuỷ phõn cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoỏ bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin tạo nờn từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone với phenol nhờ xỳc tỏc của peroxydase. Cỏc phản ứng:
Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid bộo Cholesterol + O2 Chlesterol-3-one + H2O
H2O2 + 4-aminophenazone + Phenol Quynonimin + H2O Đo mật độ quang của Quynonimin ở bước súng 546nm (bằng mỏy Olympus AU400), so với ống chuẩn để tớnh kết quả.
c) Định ượng HDL-c
Nguyờn tắc: Xột nghiệm gồm hai bước đ c hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phỏ hủy bằng cỏc phản ứng enzyme đ c hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự cú m t của chất surfactant đ c hiệu cho HDL Lipase Glycerolkinase GPO Peroxydase CHE CHO Peroxydase
Bước 1: Chylomicron, LDL, VLDL Cholestenon + H2O 2H2O2 2 H2O + O2 Bước 2: HDL Cholestenon + H2O2 H2O2 + Chromogen Sắc tố quynon 2.2.6. Xử lý số liệu
Chỉ số glucose huyết được so sỏnh giữa thời điểm trước và sau nghiờn cứu; so sỏnh giữa cỏc lụ dựng thuốc và lụ đối chứng ở cựng thời điểm.
* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tớnh theo cụng thức
Tỷ lệ tăng glucose huyết:
X1% =
X1 – Tỷ lệ tăng glucose huyết
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đỏnh giỏ
Sự khỏc biệt được kiểm định bằng thuật toỏn t- test student với P < 0.05 cú ý nghĩa thống kờ.
* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (CHL, HDL-C, LDL-C, TG) được tớnh theo cụng thức dưới đõy Tỷ lệ % hạ glucose huyết: X2% = X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết B – A A x 100 B - A A x 100 CHE + CHO
Điều kiện đặc biệt
Catalase
CHE + CHO Surfactant đặc hiệu
A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đỏnh giỏ
Sự khỏc biệt được kiểm định bằng thuật toỏn t- test student với P< 0.05 cú ý nghĩa thống kờ.
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tỏch chiết cỏc phõn đ ạn dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm (Morus alba L.)
3.1.1. Quy trỡnh tỏch chiết cỏc phõn đ ạn dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm
Hỡnh 3.1. Quy trỡnh chiết xuất cỏc chất tự nhiờn từ lỏ cõy Dõu tằm
Bó sau khi chiết bằng n –hexan 39.6g Cao
n –hexan
Chiết bằng n –hexan
Bó sau khi chiết bằng ethylacetate 32g Cao
ethylacetate 150g Cao ethanol Bó sau khi chiết
bằng ethanol
Chiết ethanol 3 lần 3000g lỏ cõy Dõu tằm khụ
Chiết bằng ethylacetate
Từ 3 kg bột lỏ cõy Dõu tằm khụ được ngõm kiệt 3 lần trong ethanol 80%, loại dung mụi dưới ỏp suất giảm thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số là 200g. Giữ lại 50g dựng cho quỏ trỡnh phõn tớch và điều trị cho chuột, khối lượng cao cồn cũn lại (150g) dựng để tỏch chiết qua cỏc dung mụi hữu cơ cú độ phõn cực khỏc nhau. Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua cỏc dung mụi của lỏ cõy Dõu tằm được trỡnh bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khối lượng cao thu được khi chiết qua cỏc phõn đ ạn và hiệu suất
Mẫu Cỏc PĐ
Lỏ Dõu tằm
Mẫu an đầu (g) Mẫu khụ
tuyệt đối (g) Hiệu suất chiết rỳt (%) EtOH 150 23.5 15,7 N-Hexan 39.6 1.7 4.3 Ethylacetate 32 1.12 3.5
(Tớnh theo nguyờn liệu khụ ban đầu)
Từ phương phỏp chiết rỳt được trỡnh bày ở hỡnh 3.1, chỳng tụi đó thu được một số cao phõn đoạn tan trong cỏc dung mụi hữu cơ cú độ phõn cực khỏc nhau để sử dụng cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo.
3.1.2. Kết quả định tớnh cỏc hợp chất tự nhiờn tr ng cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm
Chỳng tụi tiến hành định tớnh thành phần một số hợp chất tự nhiờn thụng qua cỏc phản ứng húa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trỡnh bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2 .Bảng kết quả định tớnh một số hợp chất tự nhiờn trong cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm
Chỳ thớch:
(-): Khụng phản ứng (+): Phản ứng
(++): Phản ứng mạnh
Kết quả trỡnh bày ở bảng 3.2 cho thấy một số phõn đoạn dịch chiết từ lỏ dõu tằm cho kết quả phản ứng với cỏc thuốc thử trờn. Đỏng chỳ ý là phản ứng định tớnh flavonoid, glycoside, tannin cho kết quả khỏ rừ. Kết quả định tớnh cho thấy ethanol là một dung mụi tỏch chiết tốt nhất đối với cỏc hợp chất tự
Nhúm chất Phản ứng nhận biết Lỏ cõy Dõu tằm
EtOH N-hex EtOAc
Flavonoid Shinoda ++ + + Diazo ++ + ++ NaOH 10% + + + H2SO4 ++ + + Tannin Vanillin - - - FeCl3/HCl ++ ++ +++ Gelatin + - - Alkaloid Dragendorf + + - Bouchardat - + - Glycoside Keller-Kilian ++ ++ ++ Saponin Tạo bọt - - -
nhiờn, tiếp đú là đến phõn đoạn n-hexan và cuối cựng là phõn đoạn
ethylaxetate.
3.1.3. Phõn tớch thành phần cỏc hợp chất tự nhiờn trong dịch chiết lỏ Dõu tằm bằng sắc kớ lớp mỏng tằm bằng sắc kớ lớp mỏng
Chỳng tụi đó tiến hành chạy sắc kớ bản mỏng trỏng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ dung mụi khỏc nhau. ua thăm dũ cho thấy hệ dung mụi TEAF (5:3:1:1) (Toluen-Ethylacetate-Acetone-acid Formic) là cho kết quả rừ nột nhất và được chỳng tụi lựa chọn.
Hỡnh 3.2. Sắc ký đồ cỏc ph n đoạn
Kết quả sắc ký đồ hỡnh 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch cú màu sắc khỏc nhau.
Qua quan sỏt trờn sắc ký đồ, chỳng tụi nhận thấy kết quả sắc ký đồ của cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ Dõu tằm xuất hiện khỏ nhiều vạch màu vàng (cỏc hợp chất thuộc nhúm flavonoid), màu xanh (diệp lục), màu tớm (tecpen). Trờn sắc kớ đồ cho thấy phõn đoạn cao ethanol xuất hiện nhiều băng vạch nhất khoảng 14 – 15 băng vạch, tiếp đến là phõn đoạn n-hexan khoảng 12 vạch.