1.5.1. Đặc điểm sinh học
Dõu tằm (Morus alba L.) hay cũn gọi là dõu ta, dõu trắng, dõu cang thuộc họ Dõu tằm (Moracaae) là một loài cõy gỗ từ nhỏ đến nhỡ, lớn nhanh, cú thể cao tới 15-20 m. Cõy gỗ nhỏ, cao khoảng 3m. Cành mềm, lỳc non cú lụng, sau nhẵn và cú màu xỏm trắng, chồi nỏch nhỏ màu nõu vàng. Vỏ thõn cú nốt sần, cú mủ trắng như sữa. Lỏ mọc so le, hỡnh bầu dục, hỡnh tim ho c hỡnh trứng rộng, cú mũi nhọn ở đầu, phiến mỏng, mềm, dài 5-10 (15) cm, rộng 4-8 (10) cm, m p cú răng cưa đều, phiến nguyờn hay đụi khi chia 3-5 thựy trờn cỏc nhỏnh cũn non, 3 gõn ở gốc, cỏc gõn bờn đạt tới chiều dài của phiến, đụi gõn bờn tận cựng ở ẵ chiều dài phiến lỏ. M t trờn của lỏ màu lục sẫm hay lục xỏm, m t dưới màu lục nhạt hơn, nổi rừ cỏc gõn lớn chạy từ cuống lỏ và nhiều
gõn nhỏ hỡnh mạng lưới, cú lụng tơ mịn rải rỏc trờn gõn lỏ. Cuống dài 2-4 cm, mảnh, cú lụng thưa. Lỏ hàng năm rụng vào mựa đụng. Lỏ kốm cũn non hỡnh tam giỏc nhọn, khi già xoắn lại thành hỡnh dải đầu nhọn [13].
Cõy Dõu tằm(Morus alba L.) tại Việt Nam gọi đơn giản là cõy dõu, hay cõy dõu trắng cú nguồn gốc ở khu vực phớa Đụng Chõu Á. Cõy dõu ưa khớ hậu mỏt và kho nờn mọc được ở nhiều vựng đất, mọc nhiều ở vựng nhiệt đới, cũn vựng ụn đới thỡ mọc vào mựa hố.
1.5.2. Thành phần húa học
Lỏ dõu tằm chứa cỏc thành phần bay hơi như tinh dầu (0,0035%), cỏc thành phần khụng bay hơi gồm protein, carbohydrat, flavonoid, coumarin, vitamin…Cỏc flavonoid: rutin, quercetin, moracetin (quercetin-3-triglucosid), quercitrin (quercetin 3- rhamnosid), isoquercitrin (quercetin-3- glucosid). Cỏc dẫn chất coumarin: umbeliferon, scopoletin, scopolin. Cỏc vitamin B, C, D, caroten. Cỏc sterol: β-sitosterol, campesterol, β-sitosterol glycosid, β- ecdyson và inokosterol. Cỏc acid hữu cơ: oxalic, malic, tartric, citric, fumaric, palmitic và ester ethyl palmitat [1].
1.5.3. Một số tỏc dụng Sinh - dược và cụng dụng của lỏ cõy Dõu tằm.
Lỏ cõy Dõu tằm (Đụng y gọi là Tang diệp) cú vị đắng ngọt, tớnh hàn, cú cụng hiệu mỏt gan sỏng mắt, thư phong tỏn nhiệt, lợi ngũ tạng, thụng khớp xương, làm mượt túc, dưỡng tõn dịch, dựng chữa cảm sốt, ho, đau đầu, chúng m t, đau sưng họng, mắt đau sưng đỏ, xuất huyết do chấn thương, rết cắn, chõn phự [3].
Trong Đụng y, lỏ dõu cú một phạm vi ứng dụng lõm sàng rộng rói. Người Trung Quốc đó sử dụng lỏ dõu tằm trong cỏc bài thuốc Đụng y từ rất lõu, trước khi y học cú được bảng phõn thớch thành phần. Lỏ dõu tằm hóm lấy nước uống để chống mệt mỏi, suy nhược, mất ngủ, suy giảm miễn dịch, hỗ trợ hạ đường huyết. Dõu tằm cũn chứa nhiều sắt, rất tốt cho những người thiếu mỏu do sắt và phụ nữ mang thai. Một số thực nghiệm lõm sàng cho thấy ăn lỏ dõu hằng ngày (canh lỏ dõu, canh hến lỏ dõu ho c xào với trứng) ho c nước hóm lỏ dõu cú khả năng ổn định huyết ỏp, nhịp tim, đường huyết, làm giảm đỏng kể nguy cơ đột quỵ ở nhúm người tăng huyết ỏp và biến chứng ở người tiểu đường.
Tỏc dụng chữa bệnh: lỏ dõu (tang diệp) cú tỏc dụng hạ sốt, chữa cảm mạo, hạ huyết ỏp, làm sỏng mắt, chữa chứng mồ hụi trộm ở tr nhỏ, chứng thổ huyết, làm lành vết thương [1],[3].
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU 2.1. Đối tượng nghiờn cứu
2.1.1. Mẫu thực vật
+ Lỏ cõy Dõu tằm (Morus alba L.)
+ Bộ phận sử dụng: lỏ
+ Địa điểm, thời gian thu mẫu: Lỏ Dõu tằm được thu vào thỏng 8 năm 2012 tại huyện Súc Sơn – Hà Nội.
Hỡnh 2.1. Cõy Dõu tằm (Morus alba L.)
2.1.2. Mẫu động vật
Chuột bạch chủng Swiss n ng từ 14 - 16g được nuụi BP và gõy ĐTĐ type 2 do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp.
2.1.3. Húa chất và dụng cụ thớ nghiệm
* STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse.
* Ethanol 900, Húa chất dựng cho quỏ trỡnh tỏch chiết, định tớnh, định lượng như n-hexan, ethylacetate…
* Mỏy đo đường huyết tự động One Touch Ultra.
* Bộ kớt thử Medisense optium blood glucose electrodes.
* Cõn phõn tớch, mỏy ly tõm, lũ vi súng, mỏy lắc vontex, pipetman… Cỏc thiết bị đều đảm bảo tiờu chuẩn về độ chớnh xỏc và an toàn.
2.2. Phương phỏp nghiờn cứu
2.2.1. Phương phỏp tỏch chiết mẫu nghiờn cứu
Chiết cao tổng số: Dựng 3kg bột mẫu thực vật khụ được chiết 3 lần với
ethanol 80%. Sau khi cho dung mụi chiết vào mẫu (tỉ lệ mẫu : dung mụi = 1:3), khuấy đều và tiến hành siờu õm trong lạnh với tần suất 15Hz/30 phỳt và tiếp tục được ngõm trong vũng 1 tuần cú lắc liờn tục. Sau đú tiến hành lọc qua giấy lọc Whatman No.1, gom cỏc dịch lọc, thu loại dung mụi trờn mỏy cụ chõn khụng ở 30 – 400C thu được cao tổng số.
Chiết ph n đoạn cỏc hợp chất tự nhiờn: Hũa tan cao tổng số trong một
thể tớch tối thiểu nước ấm cho tới khi tan hoàn toàn, sau đú tiến hành chiết phõn đoạn qua cỏc dung mụi với độ phõn cực tăng dần: n- hexan; ethylaxetat. Mỗi phõn đoạn được chiết 3 lần và tớnh kết quả trung bỡnh. Khối lượng cỏc phõn đoạn dịch chiết trong cỏc thớ nghiệm được tớnh giỏn tiếp từ thành phần phần trăm của mẫu khụ tuyệt đối.
2.2.2. Phương phỏp khảo sỏt thành phần húa học của cõy Dõu tằm
(Morus alba L.)
2.2.2.1. Định tớnh một số nhúm hợp chất tự nhiờn
Cao cỏc phõn đoạn được hũa tan trong dung mụi thớch hợp với từng loại phản ứng định tớnh [6]. Cỏc nhúm phản ứng được trỡnh bày túm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng cỏc phản ứng định tớnh đặc trưng
Nhúm hợp
chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCL
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự cú m t của flavon, flavonol và cỏc dẫn xuất hydro của chỳng
Diazo húa Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tớnh
Dung dịch
kiềm NaOH 10%
Phản ứng cú kết quả dương tớnh khi xuất hiện màu vàng cam
Acid sulfuric H2SO4 10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự cú m t của favon và flavonol, màu đỏ hay nõu cho thấy sự cú m t của chalcon và auron
Vanilin/HCL Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự cú m t của catechin.
Tannin
Vaninlin/H2SO4
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu đỏ đậm.
Dung dịch 5%, Gelatin/1% NaCL
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện kết tủa.
Acetate chỡ 10% Phản ứng dương tớnh nếu kết tủa xuất hiện.
Alkaloid Bouchardat Hỗn hợp KI+I2/HCL
Phản ứng dương tớnh nếu cú màu đỏ thẫm
vansMayer Hỗn hợp HgCL2+ KI
Phản ứng dương tớnh nếu cú kết tủa màu trắng ho c vàng nhạt. Dragendorf Phản ứng dương tớnh nếu cú kết
tủa màu da cam.
Glycoside Keller-Killian
Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện vũng đỏ nõu ở bề m t phõn cỏch giữa hai lớp chất lỏng.
Polyphenol khỏc
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu vàng.
FeCL3/HCL Phản ứng dương tớnh nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen.
2.2.2.2. Định lượng polyphenol tổng số the phương phỏp F lin Ciocalteau
Nguyờn tắc: dựa trờn phản ứng của cỏc hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trờn mỏy quang phổ UV VIS 1000 ở bước súng λ = 765 nm, dựng chất chuẩn là acid gallic .
Cỏc bước tiến hành như sau:
* Chuẩn bị mẫu định lượng và húa chất.
Dung dịch acid gallic; 0.5 g acid gallic + 10ml C2H5OH + 90ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc aid gallic cú nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3; 200g Na2CO3+800ml H2O đun sụi. Thờm một vài giọt tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml.
* Tiến hành xõy dựng đường chuẩn acid gallic.
Chuẩn bị cốc định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0,1, 2, 3, 5 và 10ml sau đú dẫn nước cất tới 100ml ta thu được cỏc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, và 500mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 àl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở cỏc nồng độ ho c dịch chiết cỏc phõn đoạn ) + 1.58 ml H2O + 100 àlthuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giõy đến 8 phỳt cho thờm 300 àl Na2CO3. Để hỗn hợp dunh dịch phản ứng trong hai giờ ở 200c rồi xỏc định ở bước súng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
* Kết quả xõy dựng đường chuẩnacid gallic
Bảng 2.2 Kết quả đường chuẩn gallic
STT Acid gallic (mg/l) OD 765nm 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519
Hỡnh2.3. Đồ thị chuẩn acid gallic
Đ? th? chu?n acid gallic
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 mg Acid gallic O D 7 65 n m y = 0.001x + 0.0128
Định lượng polyphenol tổng số:
Cõn 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phõn đoạn dịch chiết hũa tan trong 1 ml ethanol 90%, bổ sung thờm nước cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu được dung dịch gốc cú nồng độ chất tan là 10.000 mg/l. Lấy 1 ml dung dịch gốc hũa với 9 ml nước cất thu được dung dịch cao cú nồng độ 1000 mg/l.
Tiến hành thớ nghiệm tương tự như đối với dung dịch acid gallic, xỏc định giỏ trị OD, từ đú tớnh nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khối lượng polyphenol trong mỗi phõn đoạn dịch chiết.
Theo đú:
Hàm lượng polyphenol trong dung dịch = 1000 (OD – 0,0128) (mg/l)
2.2.3. Nghiờn cứu tỏc dụng của dịch chiết cỏc phõn đ ạn lỏ cõy Dõu tằm lờn trọng lượng và một số chỉ số húa sinh mỏu của chuột BP thực nghiệm 2.2.3.1. Xõy dựng mụ hỡnh chuột BP thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm súc bỡnh thường trong 3-4 ngày để thớch ứng với mụi trường mới sau đú tiến hành phõn chuột thành 2 nhúm với hai chế độ dinh dưỡng như sau [17]:
Nhúm 1 - Nhúm đối chứng: Cỏc con chuột tiếp tục được chăm súc bằng thức ăn bỡnh thường (do viện Vệ sinh Dịch tễ cung cấp).
Nhúm 2 - Nhúm nuụi bộo: Cỏc con chuột được chăm súc bằng chế độ thức ăn giàu lipid và cholesterol.
Bảng 2.3. Thành phần thức ăn giàu lipid
Thành phần Tỉ lệ % Hydratcacbon 41 Lipid 32 Protein 20 Cholesterol 1 Chất khoỏng 4
Cỏc nhúm chuột được theo dừi trong vũng 8 tuần, trọng lượng của cỏc con chuột được kiểm tra hàng tuần. Vào tuần cuối cựng thời gian thớ nghiệm, sau khi xỏc định trọng lượng, chỳng tụi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiờn từ mỗi nhúm ra 10 con chuột, lấy mỏu tổng số và phõn tớch một số chỉ số lipid mỏu. Cỏc số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kờ.
2.2.3.2. Thử độc tớnh cấp, xỏc định LD50
Xỏc định độc tớnh cấp với liều lượng húa chất gõy chết cho 50 động vật thử nghiệm (LD50) của dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm theo phương phỏp Lorke [16]. Chuột nhịn đúi trước 16 giờ làm thớ nghiệm, được phõn lụ ngẫu nhiờn N=10 và cho uống theo liều tăng dần cho đến 8g/kg (liều tối đa cho ph p). Theo dừi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đỏnh giỏ mức độ độc của dịch chiết.
2.2.4. Nghiờn cứu tỏc dụng hạ đường huyết của dịch chiết lỏ cõy dõu tằm lờn chuột nhắt gõy ĐTĐ ằng STZ lờn chuột nhắt gõy ĐTĐ ằng STZ
Để tỡm hiểu tỏc dụng hạ đường huyết của dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm trước tiờn chỳng tụi tiến hành gõy mụ hỡnh chuột ĐTĐ mụ phỏng type 2 dựa trờn chế độ ăn giàu chất bộo kết hợp với STZ liều thấp [17], [18].
2.2.4.1. Phương phỏp gõy ĐTĐ thực nghiệm mụ phỏng type 2
Chuột nuụi BP được gõy ĐTĐ type 2 bằng tiờm STZ (110mg/kg pha trong đệm citrate 0.01M, pH = 4.3) dưới màng bụng, gõy rối loạn trao đổi glucose mỏu của chuột BP thực nghiệm nhằm tạo mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2 phỏt triển từ BP. Trước khi thớ nghiệm cho chuột nhịn đúi 16h. Sau đú chỳng được uống nước và ăn bỡnh thường. Sau từ 3- 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xỏc định ≥ 18 mmol/l. Tiến hành phõn cỏc lụ chuột (mỗi lụ gồm 5 con) đó bị bệnh để nghiờn cứu khả năng hạ đường huyết khi sử dụng cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm.
Lụ 2: Lụ STZ điều trị bằng phõn đoạn EtOH Lụ 3: Lụ STZ điều trị bằng phõn đoạn n-hexan Lụ 4: Lụ STZ điều trị bằng phõn đoạn EtOAc
Chuột bị bệnh uống điều trị cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm được tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột ở cỏc thời điểm khỏc nhau và tiến hành cỏc xột nghiệm tiếp theo. Sau đú tiếp tục điều trị cho chuột trong vũng 21 ngày (3 tuần).
2.2.4.2. Thử khả năng hạ glucose huyết của cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm trờn mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2
Cỏc lụ chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lụ) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cỏch cho uống phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm với liều 2000mg/kg. Đường huyết của cỏc con chuột được đo vào cựng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đúi 12 giờ ở cỏc ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị.
Bảng 2.4. Mụ hỡnh nghiờn cứu khả năng hạ glucose của cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm
Lụ Chế độ ăn
Trước điều trị Tiờm Mục đớch
1 Thức ăn chuẩn Uống nước cất, khụng điều trị. 2 Thức ăn b o STZ Uống nước cất, khụng điều trị.
3 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phõn đoạn ethanol (2000mg/kg) 4 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phõn đoạn n-hexan (2000mg/kg 5 Thức ăn b o STZ Điều trị cao phõn đoạn ethylacetate (2000mg/kg)
2.2.5. Sử dụng phương phỏp húa sinh - y dược 2.2.5.1. Phương phỏp định lượng glucose huyết 2.2.5.1. Phương phỏp định lượng glucose huyết
* Nguyờn tắc:
Nguyờn tắc hoạt động của phương phỏp dựa trờn chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương phỏp quang học để định lượng glucose huyết.
+ Phản ứng 1: Khi mỏu tiếp xỳc với bề m t của vựng phản ứng que thử, dưới xỳc tỏc đ c hiệu của glucose oxidase (GOD) cú trong kớt thử, glucose trong mỏu phản ứng với oxy (khụng khớ) tạo thành axit gluconic và hydro peroxide (H2O2).
+ Phản ứng 2: Hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O-Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong mỏy One Touch Ultra chuyển húa định lượng biểu thị bằng số mmol/L ho c mg/dl glucose.
* Tiến hành: Ấn nỳt điều khiển để khởi động mỏy. Gắn que thử vào mỏy. Dựng kim chõm chuyờn dụng chõm vào mạch mỏu ở đuụi chuột, để mỏu chảy tự nhiờn, thấm bỏ giọt đầu tiờn, lấy giọt mỏu thứ 2. Mẫu mỏu dựng cho việc đo là 1àL, phải là giọt mỏu trũn đầy, phủ kớn giọt mỏu lờn vựng phản ứng của que thử. Sau 5 giõy, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trờn màn hỡnh.
2.2.5.2. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh
Cỏc chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xỏc định trờn mỏy xột nghiệm sinh húa tự động (Phũng húa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xụ). Nguyờn tắc xỏc định của mỗi chỉ số như sau:
a) Định ượng triglycerid
Thuỷ phõn triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phúng ra bằng phương phỏp đo màu của quynonimin tạo thành từ
4- aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo cỏc phản ứng sau:
Triglycerid Glycerol + acid bộo
Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihidroxyacetone + H2O2
H2O2 + Aminoantipyrine + 4- chlorophenol Quynonimin + 4HCl + 4H2O
Đo mật độ quang học quynonimin ở bước súng 546nm (mỏy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tớnh kết quả.
b) Định ượng cholesterol toàn phần
Thuỷ phõn cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoỏ bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quynonimin tạo nờn từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone với phenol nhờ xỳc tỏc của peroxydase. Cỏc phản ứng:
Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid bộo Cholesterol + O2 Chlesterol-3-one + H2O
H2O2 + 4-aminophenazone + Phenol Quynonimin + H2O