Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 14 - 16g) được chia làm 8 lụ.
Lụ 1: cho ăn chế độ bỡnh thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương).
Lụ 2 - 8: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao.
Sau 8 tuần nuụi theo chế độ trờn, chỳng tụi tiến hành cõn trọng lượng chuột.
Hỡnh 3.3. Chuột bộo phỡ (A) và chuột nuụi thường (B)
Kết quả sự thay đổi trọng lượng của chuột thớ nghiệm được thể hiện ở bảng 3.5 và hỡnh 3.4.
B
Bảng 3.5. Trọng lượng trung nh của hai nhúm chuột nuụi ằng hai chế độ dinh dưỡng khỏc nhau.
(Số liệu thể hiện trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của cỏc lụ chuột; (*): p < 0.05 so sỏnh với nhúm ăn thường)
Hỡnh 3.4. Biểu đồ iểu diễn sự tăng trọng của cỏc nhúm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khỏc nhau tr ng vũng 8 tuần.
Bảng 3.5 và hỡnh 3.4 đó cho thấy rằng chuột được nuụi theo chế độ ăn cú hàm lượng lipid và cholesterol cao cú khả năng tăng về trọng lượng lớn
Nhúm chuột
Trọng lượng trung bỡnh của chuột tại cỏc thời điểm khỏc nhau (g) Ban đầu Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4 Tuần 5 Tuần 6 Tuần 7 Tuần 8 Nhúm ăn thường 15.67 19.05 23.46 27.23 29.17 31.34 34.52 37.03 40.31 ±1.07 ±0.50 ±0.65 ±0.45 ±0.50 ±0.75 ±0.84 ±1.25 ±1.54 Nhúm ăn bộo 15.35 21.08 28.76 35.89 41.17 46.43 49.57 53.38 57.96 ±1.20 ±1.52 ±1.57 ±2.31 ±2.46 ±2,05 ±2.70 ±2.38 ±2.94 (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*)
hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khỏc này là cú ý nghĩa thống kờ với trị số p < 0.05. Cụ thể là:
Tại thời điểm ban đấu sự khỏc nhau về trọng lượng khụng cú ý ngĩa thống kờ (p> 0.05).
Sau 8 tuần nuụi, chuột nuụi với chế độ ăn thường trọng lượng cơ thể chỉ tăng thờm 24,64g tương ứng tăng lờn 157,24 so với ban đầu, trong khi nhúm chuột ăn b o trọng lượng cơ thể tăng thờm 42,61g ứng với 277,58% so với ban đầu. Như vậy, nhúm chuột ăn b o đó tăng trọng lượng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 17,97g hay gấp 1.73 lần. Đõy là một kết quả khả quan, phự hợp với thực nghiệm nuụi bộo chuột của TS. Phựng Thanh Hương [8].
Để đỏnh giỏ ảnh hưởng của chế độ nuụi b o đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cựng của thời gian nuụi bộo sau khi cho nhịn đúi qua đờm, chỳng tụi lựa chọn ngẫu nhiờn 10 con chuột, lấy mỏu tổng số và phõn tớch một số chỉ số hoỏ sinh. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.6 và hỡnh 3.5 sau đõy.
Bảng 3.6. So sỏnh một số chỉ số húa sinh mỏu giữa chuột nuụi thường và nuụi bộo phỡ thực nghiệm.
Nhúm Cỏc chỉ số lipid (mmol/l) Glucose
(mmol/l) TC TG HDL-c LDL-c Nhúm ăn thường 4.16 1.42 1.63 1.15 6.72 ±0.12 ±0.13 ±0.10 ±0.14 ±0.45 Nhúm ăn 5.37* 2.20* 0.72* 1.74* 7.95* ±0.24 ±0.17 ±0.05 ±0.13 ±0.37 So sỏnh lụ bộo / thường ↑1.29 Lần ↑1.55 Lần ↓0.44 Lần ↑1.51 Lần ↑1.18 Lần
(Số liệu thể hiện trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của 10 con chuột; (*): p < 0.05 khi so sỏnh với nhúm ăn thường)
Hỡnh 3.5. Biểu đồ so sỏnh một số chỉ số húa sinh giữa cỏc lụ chuột TNo.
Kết quả ở bảng 3.6 và hỡnh 3.5 cho thấy cỏc chỉ số húa sinh đó cú sự khỏc biệt giữa lụ chuột nuụi thường và lụ chuột nuụi bộo. Cụ thể:
Sau 8 tuần, nhúm chuột cho ăn thức ăn b o cú hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, LDL-c trong huyết thanh đều cao hơn với khoảng tin cậy > 95% (p<0.05) so với nhúm ăn bằng thức ăn thường. Hàm lượng cholesterol toàn phần / triglyceride / LDL-c/ Glucose trong huyết thanh của nhúm chuột nuụi b o tương ứng tăng gấp 1.29 / 1.55 / 1.51/ 1.18 lần so với nhúm chuột nuụi bằng thức ăn thường. Tuy nhiờn, hàm lượng HDL –c lại cú sụt giảm mạnh, chuột nuụi thức ăn b o (0.72 mmol/l) giảm 0.44 lần so với chuột nuụi thường (1.63 mmol/l), với P < 0.05.
Kết quả này hoàn toàn phự hợp thực tế và với kết quả nghiờn cứu của Srinivasan và cộng sự [13]. Như vậy, với chế độ nuụi b o đó gõy rối loạn trao đổi lipid và glucid ở chuột.
Kết quả trờn cú thể giải thớch là do bỡnh thường 70% tới 75% cholesterol được tạo ra bởi gan; cũn lại 20% đến 25% do cỏc loại chất bộo từ thức ăn cú mỡ động vật và thực vật mang vào cơ thể nhưng khi chuột được ăn
thức ăn cú thành phần giàu lipid (32%) và cholesterol (1%) hay hàm lượng chất bộo quỏ nhiều, gan khụng thể chuyển húa hết được sẽ tạo ra nhiều VLDL và biến thành LDL. Và nếu khụng đủ HDL để mang chất mỡ xấu LDL đi thỡ đương nhiờn hàm lượng của triglyceride và cholesterol toàn phần trong mỏu tăng, sự tăng ở đõy chủ yếu là do thu nhận từ quỏ trỡnh tiờu hoỏ.
TG – Triglyxeride hay mỡ trung tớnh là thành phần chủ yếu của dầu, mỡ động thực vật. Tế bào của mụ hấp thụ triglycerid và tiờu dựng theo nhu cầu, khi dư thừa nú tớch tụ trong tế bào và trở thành dạng năng lượng dự trữ trong cỏc mụ mỡ nờn phần lớn chất b o trong cơ thể được dự trữ dưới dạng Triglyxerid để dựng tạo năng lượng. Trong thời gian dài chuột luụn cú chế độ ăn dư thừa triglycerid nờn khụng những trọng lượng tăng mà hàm lượng triglycerid trong mỏu cũng ứ đọng rất cao. Đỏng chỳ ý là sự biến thiờn hai chỉ số HDL-c và LDL-c. HDL-c và LDL-c là hai dạng lipoprotein cú thành phần giàu cholesterol (lần lượt chứa 18% và ~ 70%) tham gia vào quỏ trỡnh trao đổi cholesterol của cơ thể theo hai chiều ngược nhau. LDL – c, cú tỷ trọng thấp là một loại chất bộo tệ hại nhất, gọi là mỡ xấu. Tỏc dụng của LDL – c là mang chất mỡ từ gan đến khắp cơ thể và bỏm vào thành động mạch làm nú h p lại hay đõy là tỏc nhõn gõy xơ vữa và làm tắc nghẽn động mạch ở người bộo phỡ, dễ gõy nhồi mỏu cơ tim và đột tử khi gõy tắc mạch mỏu nóo. HDL – c, cũn gọi là mỡ tốt, cú nhiệm vụ chuyờn trở cỏc chất mỡ dư thừa từ tế bào ngoại vi mang trở lại gan và được thải qua đường mật, HDL ngăn cản mỡ xấu LDL bỏm vào thành động mạch.
Như vậy cú thể kết luận mụ hỡnh gõy chuột bộo phỡ bằng cỏc chế độ ăn giàu chất b o đó thành cụng. Chuột b o phỡ được tiếp tục sử dụng cho những nghiờn cứu tiếp theo.
3.4. Tỏc dụng hạ gluc se huyết của dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm trờn mụ h nh chuột ĐTĐ type 2.
3.4.1. Kết quả tạo mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm.
Với nguyờn tắc kết hợp giữa chế độ ăn b o trong thời gian dài và tiờm màng bụng STZ (pha trong đệm Citrat 0,01M, pH 4,5) với liều đơn 100 mg/kg thể trọng, chỳng tụi đó thành cụng trong việc gõy ĐTĐ type 2 thực nghiệm. Sau 3 – 4 ngày những con chuột này bị bệnh với nồng độ glucose huyết được xỏc định > 18mmol/l.
Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.7 và cú so sỏnh với cỏc lụ chuột chỉ ăn thường tiờm STZ, chuột thường và chuột bộo chỉ tiờm đệm (Citrat 0,01M, pH 4,5).
Bảng 3.7. Nồng độ glucose huyết của cỏc lụ chuột trước và sau khi tiờm STZ.
Cỏc lụ chuột Nồng độ glucose huyết (mmol/l)
Trước khi tiờm Sau khi tiờm 72 giờ
Chuột thường tiờm đệm 6.69 ± 0.4 6. 74 ± 0.27 Chuột thường tiờm STZ
(100mg/ kg) 6.72 ± 0.23
8.12 ± 0.34
p < 0.001
Chuột b o phỡ tiờm đệm 7.91 ± 0.22 8.15 ± 0.31 Chuột bộo phỡ tiờm STZ
(100mg/ kg) 7.78 ± 0.42
22.38 ± 2.36
p < 0.001 (Ghi chỳ: p: là mức ý nghĩa so với thời điểm trước khi tiờm)
Hỡnh.3.6. Nồng độ gluc se huyết lỳc đúi của cỏc lụ chuột thớ nghiệm
Qua bảng 3.7 và hỡnh 3.6 cho thấy:
- Giữa chuột bộo và chuột thường cú tăng nh về mức glucose huyết (trước khi tiờm).
- Ở lụ bộo phỡ tiờm STZ, nồng độ glucose huyết tăng một cỏch rừ rệt so với cỏc lụ thường và so với trước khi tiờm. Nồng độ glucose huyết của cỏc con chuột bộo sau tiờm STZ 72 giờ là 22.38 mmol/l. Khi tiến hành gõy ĐTĐ bằng STZ trờn mụ hỡnh chuột b o, đều cú glucose huyết tăng cao. Điều này chứng tỏ: hiện tượng - cơ chế bộo phỡ, rối loạn trao đổi lipid khi bị nhiễm chất độc vào cơ thể sẽ chuyển sang trạng thỏi ĐTĐ type 2 bền vững, khú phục hồi (Lenzen, S. 2008) [15].
3.4.2. Tỏc dụng của cỏc phõn đ ạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằmđến nồng độ gluc se huyết lỳc đúi của chuột ĐTĐ.
Cỏc lụ chuột ĐTĐ type 2 được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cỏch cho uống phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm với cỏc mụ hỡnh thớ nghiệm như trong phần phương phỏp nghiờn cứu, chỳng tụi thu được kết quả thể hiện trong bảng 3.8 và hỡnh 3.7.
Bảng 3.8. Kết quả nồng độ gluc se huyết lỳc đúi của cỏc lụ chuột sau 21 ngày điều trị.
Cỏc lụ chuột điều trị
Nồng độ glucose huyết lỳc đúi (mm l/l) Trước điều trị 5 ngày điều trị 10 ngày điều trị 15 ngày điều trị 21 ngày điều trị 1 Chuột ăn chuẩn 6.69 6.65* 6.77* 6.80* 6.71* ±0.4 ±0.2 ±0.3 ±0.5 ±0.2 (↓0.6%) (↑1.2%) (↑1.6%) (↓0.3%) 2 Chuột ĐTĐ khụng điều trị 21.15 22.78* 22.09* 23.18* 21.45* ±2.1 ±1.4 ±1.3 ±1.6 ±1.4 (↑7.7%) (↑4.4%) (↑9.6%) (↑1.4%) 3 Chuột ĐTĐ + EtOAc 22.3 19.5** 18.7** 15.4** 13.4** ±2.9 ±1.7 ±2.5 ±1.3 ±1.6 (↓12.6%) (↓16.1%) (↓30.9%) (↓39.9%) 4 Chuột ĐTĐ + n-Hexan 21.6 18.2** 17.1** 14.1** 10.9*** ±4.2 ±1.9 ±1.7 ±0.9 ±1.6 (↓15.7%) (↓20.8%) (↓34.7%) (↓49.5%) 5 Chuột ĐTĐ + EtOH 22.5 17.5** 16.2** 11.8** 9.7** ±3.9 ±1.6 ±1.8 ±2.0 ±0.8 (↓22.2%) (↓28.0%) (↓47.6%) (↓56.9%)
(Ghi chỳ: Số liệu thể hiện trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của 6 con chuột/lụ; cỏc giỏ trị p là: *:(p>0.05); **:(p<0.05); ***: (p<0.01) là những giỏ trị cú ý nghĩa thống kờ của cỏc lụ chuột so sỏnh với lụ chuột trước khi điều trị ở cựng thời điểm (5,10,15,20) ngày, trong đú () sự giảm, (↑) sự tăng glucose huyết).
Hỡnh 3.7. Nồng độ gluc se huyết lỳc đúi của cỏc lụ chuột trước và sau 21 ngày điều trị.
Qua bảng 3.8 và hỡnh 3.7 cho thấy:
- Lụ chuột ăn chuẩn cú nồng độ glucose huyết tăng giảm thất thường. Lụ chuột ĐTĐ khụng điều trị cú nồng độ glucose huyết luụn tăng, chứng tỏ lụ chuột này bị bệnh ĐTĐ ngày càng nghiờm trọng hơn.
- Tỏc dụng của cỏc phõn đoạn dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm đến khả năng hạ đường huyết cho thấy rằng: phõn đoạn đều cú tỏc dụng giảm mạnh đường huyết qua cỏc ngày điều trị và giảm rừ nhất sau ngày thứ 15 và ngày 21. Cụ thể: + Phõn đoạn cao ethanol cú tỏc dụng giảm mạnh nhất, rừ nhất sau 15 ngày điều trị với nồng độ glucose huyết là 11.8 mmol/l tương ứng với giảm 47.6% so với trước điều trị là 22.5 mmol/l (p < 0.05)) và đến ngày thứ 21 thỡ mức đường huyết giảm xuống cũn 9.7 mmol/l tương ứng giảm 56.9%.
+ Cao phõn đoạn n- hexan cú tỏc dụng giảm khụng mạnh như ở phõn đoạn cao ethanol tuy nhiờn nú mạng tớnh ổn định và tương đối hiệu quả qua cỏc ngày điều trị và giảm mạnh nhất sau ngày 21 điều trị xuống cũn 10.9 mmol/l
tương ứng giảm 49.5% so với trước điều trị là 21.6 mmol/l (p < 0.05). Tiếp theo là cao phõn đoạn ethylaxetat sau 21 ngày điều trị giảm xuống cũn 13.4 mmol/l, tương ứng với giảm 39.9% so với trước điều trị là 22.3 mmol/l (p < 0.01).
Như vậy, cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm cú tỏc dụng trong giảm nồng độ glucose huyết ở chuột bị ĐTĐ.
Từ kết quả trờn ta cú thể giải thớch do trong lỏ cõy Dõu tằm cú chứa nhiều hợp chất cú tỏc dụng giảm glucose huyết như: Flavonoid, tannin, alkaloid, glycoside, tannin và polyphenol.
3.5. Tỏc dụng đến chuyển húa lipid của lỏ cõy Dõu tằm trờn mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2. chuột ĐTĐ type 2.
Để đỏnh giỏ ảnh hưởng của cỏc phõn đoạn dịch chiết lỏ cõy Dõu tằm đến một số chỉ số lipid trong huyết thanh của chuột vào ngày cuối cựng của thời gian điều trị, sau khi cho nhịn đúi qua đờm, chỳng tụi chọn 3 lụ chuột cú chỉ số đường huyết thấp, lấy mỏu tổng số và phõn tớch một số chỉ số hoỏ sinh. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.9 và hỡnh 3.8 sau đõy.
Bảng 3.9. S sỏnh một số chỉ số lipid mỏu ở chuột ĐTĐ trước và sau điều trị ằng ca phõn đ ạn ethan l, ca phõn đ ạn n – hexan và cao phõn
đ ạn ethylacetate. Chỉ số Húa sinh Trước điều trị Chuột ĐTĐ điều trị Ca PĐ EtOH Ca PĐ N – hexan Ca PĐ EtOAc Cholesterol tổng số (mmol/l) 5.63 ± 0.31 5.30* ± 0.32 4.89* ± 0.15 3.78* ± 0.18 ↓ 5.85% ↓ 13.14% ↓ 32.62% Triglyceride (mmol/l) 2.23 ± 0.24 1.05* ± 0.16 2.17* ± 0.24 1.51* ± 0.32 ↓ 52.91% ↓ 2.69% ↓ 32.28% HDL –c (mmol/l) 0.71 ± 0.15 1.24* ± 0.17 1.85* ± 0.28 1.43* ± 0.25 ↑ 74.6% ↑ 160.6% ↑ 101.4% LDL –c (mmol/l) 1.85 ± 0.12 0.99* ± 0.19 0.77* ± 0.13 1.15* ± 0.17 ↓ 46.2% ↓ 58.8% ↓ 37.9%
(Số liệu thể hiện trong bảng là giỏ trị trung bỡnh của 5 con chuột/lụ; (*): p < 0.05 khi so sỏnh với chuột trước điều trị.)
5.63 5.3 4.89 3.78 2.23 1.05 2.17 1.51 0.71 1.24 1.85 0.75 1.85 0.98 0.75 1.13 0 1 2 3 4 5 6 Cholesteron tổng số Triglyceride HDL-c LDL-c Trước điều trị Chuột ĐTĐ+EtOH Chuột ĐTĐ+ N-hexan Chuột ĐTĐ+ EtOAc
Hỡnh 3.8. S sỏnh một số chỉ số lipid mỏu ở chuột ĐTĐ trước và sau điều trị ằng ca phõn đ ạn ethan l, ca phõn đ ạn n – hexan và cao phõn
đ ạn ethylacetate.
mmol/l
Chỉ số húa sinh
Qua bảng 3.9 và hỡnh 3.8 cho thấy:
- Chuột b o phỡ đó cú những biểu hiện về rối loạn lipid mỏu với 2 chỉ số quan trọng là cholesterol và triglyceride.
- Sau 21 ngày điều trị bằng phõn đoạn EtOH, phõn đoạn n – hexanvà phõn đoạn cao EtOAc thỡ chỉ số cholesterol toàn phần giảm tương ứng 5.85%, 13.14% và 32.62%, chỉ số triglyceride giảm tương ứng 52.91%, 2.69% và 32.28%; chỉ số LDL-c giảm mạnh nhất: giảm 58.8 khi điều trị bằng phõn đoạn n – hexan, giảm 46.2 khi điều trị bằng phõn đoạn EtOH và giảm 37.9% khi điều trị bằng phõn đoạn cao EtOAc.
- Sau 21 ngày điều trị. chỉ số HDL – c cú xu hướng tăng mạnh: tăng 74.6 khi điều trị bằng phõn đoạn EtOH, tăng 160.6 khi điều trị bằng phõn đoạn cao n – hexan và tăng 101.4 khi điều trị bằng phõn đoạn cao EtOAc.
Như vậy, kết quả bước đầu cho thấy dịch chiết cỏc phõn đoạn EtOH, phõn đoạn n – hexan và phõn đoạn EtOAc cú tỏc dụng giảm cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL –c ở cỏc mức độ khỏc nhau. M t khỏc chỉ số HDL – c lại cú xu hướng tăng. Điều đú chứng tỏ, cỏc phõn đoạn dịch chiết từ lỏ cõy Dõu tằm đều cú tỏc dụng làm giảm cỏc chỉ số húa sinh trong mỏu của chuột ĐTĐ.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiờn cứu thu được, chỳng tụi đó rỳt ra những kết luận sau: 1. Kết quả phõn tớch thành phần húa học cỏc hợp chất tự nhiờn cho thấy trong thành phần lỏ cõy Dõu tằm cú m t hầu hết những hợp chất thứ sinh thực vật quan trọng như: Flavonoid, tannin, alkaloid, glycoside, tannin và polyphenol bằng cỏc phản ứng định tớnh, kĩ thuật sắc kớ mỏng.
2. Đó xõy dựng thành cụng mụ hỡnh chuột bộo phỡ thực nghiệm bằng chế độ ăn giàu lipid và cholesterol. Sau 8 tuần, trọng lượng cơ thể của chuột b o phỡ tăng hơn chuột bỡnh thường là 17,97g hay gấp 1.73 lần. Hàm lượng cholesterol toàn phần / triglycerid / LDL-c/ Glucose trong huyết thanh của nhúm chuột nuụi b o tương ứng tăng gấp 1.29 / 1.55 / 1.51/ 1.18 lần so với nhúm chuột nuụi bằng thức ăn thường, tuy nhiờn hàm lượng HDL-c lại giảm 0.44 lần. Sự tăng, giảm này hoàn toàn cú ý nghĩa thống kờ toỏn học với p<0.05.
3. Đó xõy dựng thành cụng mụ hỡnh chuột ĐTĐ mụ phỏng type 2 bằng cỏch kết hợp nuụi bộo bằng thức ăn giàu lipid và cholesterol. Kết quả đạt được là sau 72h tiờm STZ, nồng độ glucose mỏu của tất cả chuột đều được duy trỡ ở mức cao và ổn định.
4. Về tỏc dụng của dịch chiết cỏc phõn đoạn lỏ Dõu tằm đến khả năng hạ đường huyết trờn mụ hỡnh chuột ĐTĐ type 2 sau 21 ngày điều trị: Hàm lượng glucose huyết của lụ chuột uống cao ethanol giảm xuống cũn 9.7 mmol/l tương ứng giảm 56.9%.; lụ chuột uống cao phõn đoạn n-hexan giảm