3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 2011.
2.1.1. Cơ sở thực nghiệm
Hesperidin chứa 8 nhóm OH và 1 nhóm OCH3 nên là một hợp chất phân cực mạnh, sẽ không tan trong dung môi không phân cực. Vì vậy, ta phải chọn dung môi hòa tan là các dung môi phân cực cao như methanol. Dựa vào khả năng hòa tan trong một số dung môi ta có thể đưa ra quy trình chiết như sau:
- Tách các hợp chất không hay ít phân cực bằng dung môi phân cực thấp như: n-hexane, ether dầu hỏa.
- Tách các hợp chất có độ phân cực trung bình bằng chloroform hay dichloromethane (có thể bỏ qua bước này).
- Tách hesperidin bằng dung môi phân cực cao như methanol, butanol
- Cô cạn để lấy cao thô chứa hesperidin, sau đó đem sản phẩm thô đi tinh chế với methanol thu được sản phẩm tinh.
2.1.2. Dụng cụ và hóa chất
- Vỏ quít đã được nghiền mịn: 200g - Bình cầu 3 cổ 2000ml: 1 cái - Ống sinh hàn ruột xoắn: 1 cái - Erlen có vòi 500ml: 1 cái - Bình đựng dung môi: 2 cái - n- Hexane: khoảng 4 lít - Methanol: khoảng 4 lít - Bình lọc chân không
- Hệ thống cô quay chân không BUCHI Rotavapor R-200 (Viện Công nghệ Hóa học), bếp gia nhiệt.
Hình 2.1 Hệ thống cô quay chân không
2.1.3. Tiến hành thực nghiệm
2.1.3.1. Xử lý nguyên liệu
Vỏ quít tươi loại tạp, rửa sạch, phơi khô, sau đó nghiền mịn ta thu được vỏ quít ở dạng bột có màu trắng ngà.
2.1.3.2. Chiết tách hesperidin
Lấy 200g bột vỏ quít cho vào bình cầu 3 cổ, đổ 1 lít n-hexane vào bình. Đem hỗn hợp chưng hồi lưu khoảng 1h, sau đó đem lọc. Phần nước lọc (màu vàng) sẽ được cô quay thu hồi dung môi, phần bã sẽ được chưng hồi lưu giống như trên. Quá trình được lặp lại cho đến khi nào phần nước qua lọc không còn màu nữa. Đem bã vừa lọc được ở trên sấy khô, sau đó chưng hồi lưu với methanol khoảng 1h rồi đem lọc, phần dung dịch qua lọc đem cô quay thu được sản phẩm thô, phần bã tiếp tục chưng hồi lưu khoảng 2-3 lần nữa. Sản phẩm thô sau đó được đem đi kết tinh lại bằng methanol.
Sơ đồ khối:
33
Lọc bã
Methanol lạnh
Cô quay chân không Làm đặc
Làm lạnh Lọc rửa Sấy khô Chưng hồi lưu Methanol 1 giờ 1 lít n-hexan 1 giờ 200g Vỏ quít
Chưng loại tạp, màu Lọc
Cô quay thu hồi dung môi Bã
Hình 2.2 Sơ đồ chiết tách hesperidin thô từ vỏ quít
2.1.3.3. Tinh chế
Hòa tan hesperidin thô vào methanol. Đun sôi và khuấy nhẹ bằng khuấy từ cho đến khi hòa tan hoàn toàn. Lọc nóng dung dịch bằng hệ thống lọc chân không. Dịch qua lọc được cô gần cạn bằng hệ thống cô quay chân không, sau đó làm lạnh dịch đặc này trong tủ lạnh sẽ xuất hiện tủa của hesperidin. Lọc rửa kết tủa với methanol lạnh đến khi bã lọc có màu trắng, đem sấy khô rồi cân sản phẩm thu được, ghi lại khối lượng tinh chế.
Sơ đồ khối: 34 Hesperidin thô Hòa tan Lọc nóng Methanol Methanol lạnh Làm đặc Kết tinh Lọc rửa Sấy khô Hesperdidin Dịch lọc
Hình 2.3 Sơ đồ tinh chế hesperidin
2.2. TỔNG HỢP HESPERETIN
2.2.1. Cơ sở thực nghiệm
Liên kết -O- CH2- tại vị trí 7 và vị trí liên kết giữa glucose - rhamnose của hesperidin yếu hơn so với các liên kết vòng nên dễ bị cắt bởi phản ứng thủy phân trong môi trường acid. Khi thực hiện phản ứng thủy phân hesperidin sẽ tạo thành 3 sản phẩm chính là hesperetin, glucose và rhamnose. Nếu phản ứng thủy phân thực hiên trong môi trường kiềm mạnh thì liên kết giữa oxy và carbon ở vị trí 2 sẽ bị phá vỡ để tạo nối đôi bền hơn (dạng chalcone của flavonoid). Chính vì vậy ta không thể thực hiện phản ứng tổng hợp hesperetin trong môi trường kiềm được. Quy trình đề xuất tổng hợp như sau:
- Thủy phân hesperidin bằng acid sulfuric đậm đặc trong methanol. - Lọc tách hesperidin dư sau phản ứng.
- Cô cạn thu sản phẩm thô, tinh chế lại với acetone 2.2.2. Dụng cụ và hóa chất - Hesperidin: 5gram - Methanol: 100ml - H2SO4 98%: 5ml - Acetone: 50ml - Ethylacetate: 400ml
- Nước cất, một ít NaCl, 10gram Na2SO4, sắc ký bản mỏng.
- Bình cầu 2 cổ 250ml, phễu chiết 500ml, becher 500ml, erlen 250ml, bình lọc chân không, bếp từ, cá từ.
- Than hoạt tính, cột chạy sắc ký, silicagel
2.2.3. Tiến hành thực nghiệm
Pha 5ml H2SO4 98% vào 100ml methanol rồi cho vào bình cầu 2 cổ, cân 5gram hesperidin tinh cho vào hỗn hợp dung dịch, đun hồi lưu cách thủy, khuấy nhẹ bằng cá từ. Quan sát màu của hỗn hợp (từ trắng đục sang vàng đục rồi chuyển thành dung dịch có màu nâu hơi trong), nên chấm thử hỗn hợp phản ứng với sắc ký bản mỏng (hệ dung môi chloroform: methanol là 9:1) để xem sự thay đổi trong từng giai đoạn. Dừng phản ứng khi hỗn hợp có màu nâu trong suốt và vết chấm sắc ký của tác chất biến mất (hay rất mờ do hiệu suất không thể đạt 100%). Dung dịch thu được đem lọc chân không để loại tác chất dư, cô quay chân không đến khi dung dịch còn lại khoảng 10ml, tiếp tục đem hỗn hợp này trích ly 1 lần với 200ml ethylacetate và 100ml dung dịch NaCl 10%, lấy pha nằm trên lại trích ly 3 lần nữa với 200ml ethylacetate và 200ml nước. Loại nước trong pha nhẹ bằng Na2SO4 rồi đem cô cạn ta thu được sản phẩm thô.
Sơ đồ khối: Lọc 100ml MeOH 5ml H2SO4 98% Nhiệt độ: 610C thời gian: 6h Thủy phân 5g Hesperidin
Hình 2.4 Sơ đồ tổng hợp hesperetin
Tinh chế:
Hòa tan hesperetin thô bằng 50ml acetone, thêm vào 1gram than hoạt tính, đun sôi và khuấy nhẹ cho đến khi tan hoàn toàn, lọc nóng dung dịch, dịch qua lọc (màu nâu) lại được lọc tiếp bằng cilicagel (chuyển thành màu vàng) rồi đem cô quay chân không thành một hỗn hợp sệt. Tách hesperetin trong hỗn hợp bằng máy sắc ký trung áp với hệ dung môi tăng dần từ tỉ lệ chloroform: methanol là 98:2 (Rf =0,2) đến chloroform: methanol là 82:18 (Rf = 0,8), thu hesperetin, cô gần cạn, cho vào cốc nước lạnh, khuấy đều bằng cá từ, lọc lấy tinh thể, sấy khô, cân sản phẩm tinh.
Sản phẩm thô
Cô quay chân không Na2SO4
Loại nước 200ml Ethylacetate, 100ml dd NaCl
Trích ly 200ml Ethylacetate, 200ml nước
Hình 2.5 Máy sắc ký trung áp Hình 2.6 Phổ đồ tách hesperetin bằng sắc ký trung áp Sơ đồ khối: 38 Nước lạnh Sản phẩm thô Hòa tan Lọc nóng Lọc màu Làm đặc Tách sản phẩm Làm đặc Kết tinh Lọc Sản phẩm Acetone Than hoạt tính Máy sắc ký trung áp
Cô quay chân không
Cô quay chân không Chloroform/methanol
bã
Khuấy
Hình 2.7 Sơ đồ tinh chế hesperetin
2.3. TỔNG HỢP 3’,5,7-TRIACETOXY-4’-METOXYFLAVANONE (Ký hiệu HTTA)
2.3.1. Cơ sở thực nghiệm
Đối với phản ứng ester chỉ với tác nhân acid acetic thông thường, nhóm carbonyl của acid được proton hóa hình thành cation trung gian, kế đó nguyên tử oxygen của các nhóm -OH trong phân tử hesperetin sẽ tấn công vào cation này, nhưng do hiệu ứng rút điện tử của nhân thơm nên điện tích âm của oxy trong các nhóm OH được giải tỏa vào nhân thơm, điều này làm cho mật độ điện tích âm của nó giảm mạnh, việc tấn công rất khó nên phản ứng không thể xảy ra. Đối với trường hợp này ta có thể sử dụng tác nhân là anhydride acetic trong môi trường acid hoặc môi trường kiềm, tuy nhiên nếu sử dụng acid thì phải mất thời gian trung hòa, còn
nếu phản ứng trong môi trường kiềm thì phải chọn chất tạo môi trường yếu, vì liên kết vị trí 1-2 sẽ bị đứt khi môi trường kiềm mạnh và vẫn phải tốn thời gian trung hòa, quy trình đề xuất thực nghiệm như sau:
- Ester hóa hesperetin với anhydride acetic và sodium acetate. - Làm tủa sản phẩm sau phản ứng với nước lạnh.
- Lọc thu sản phẩm thô, tinh chế lại bằng ethanol.
2.3.2. Dụng cụ và hóa chất
- Hesperetin tinh: 1gram - Anhydride acetic: 2ml - Sodium acetate: 1gram - 20ml ethanol, cốc nước đá
- Bình cầu 2 cổ 100ml, bình lọc chân không, bercher 100ml, bếp từ, cá từ, lò vi sóng, silicagel, cột chạy sắc ký.
2.3.3. Tiến hành thực nghiệm
2.3.3.1. Tổng hợp ở điều kiện thường
Cho hỗn hợp gồm 1gram hesperetin, 1gram sodium acetate và 2ml anhydride acetic vào bình cầu 2 cổ, khuấy bằng cá từ và đun hồi lưu hỗn hợp 5 phút. Lấy toàn bộ hỗn hợp này cho vào cốc nước đá đang khuấy bằng cá từ, để yên đợi kết tủa lắng xuống rồi, lọc rửa lại nhiều lần với nước lạnh ta thu được sản phẩm thô. Sấy khô sản phẩm rồi đem cân, ghi lại khối lượng thô.
Sơ đồ khối:
40
Nước lạnh Cốc nước đá
Vừa đổ vừa khuấy (CH3COO)2O / CH3COONa 5 phút, khuấy Làm lạnh nhanh Lắng Lọc Sấy khô 1g Hesperetin Ester hóa
Hình 2.8 Sơ đồ tổng hợp HTTA thô
Tinh chế:
Hòa tan HTTA thô với 20ml ethanol, đun sôi và khuấy nhẹ bằng khuấy từ cho đến khi hòa tan hoàn toàn, cho 1gram than hoạt tính vào, lọc nóng dung dịch, để bay hơi tự nhiên rồi cho vào tủ lạnh, đợi kết tủa lắng xuống, lọc lấy kết tủa thu được HTTA có dạng bột màu trắng ngà, tách chất bằng máy sắc ký trung áp với hệ dung môi tăng dần từ chloroform: methanol là 99:1 (Rf = 0,2) và 95:5 (Rf = 0,8) thu HTTA, cô cạn, sấy khô rồi cân sản phẩm tinh.
Sơ đồ khối: Nước lạnh Ethanol Máy sắc ký trung áp Hòa tan Lọc nóng Làm lạnh Lọc Tách sản phẩm Than hoạt tính bã HTTA thô
Hình 2.9 Sơ đồ tinh chế HTTA
2.3.3.2. Tổng hợp trong lò vi sóng
Quy trình cũng tương tự như trên nhưng bình cầu 2 cổ đặt bên trong lò vi sóng. Chỉnh công suất 100W, tiến hành phản ứng trong 30s, chấm thử với sắc ký bản mỏng, tiếp tục cho phản ứng thêm 1 phút nữa và cũng chấm sắc ký sau mỗi 30s, theo dõi sự thay đổi vết chấm sắc ký. Dừng phản ứng và xử lý dung dịch tương tự như trên. So sánh hiệu suất với phương pháp thông thường.
Hình 2.10 Phổ đồ tách HTTA bằng sắc ký trung áp
Sản phẩm tinh Sấy khô
2.4. TỔNG HỢP 2’,3,4,4’-TETRAMETOXY-6’-HYDROXYCHAL- CONE (Ký hiệu HTTM)
2.4.1. Cơ sở thực nghiệm
Với tác nhân acid thông thường, proton H+ sẽ tấn công vào phân tử oxy của nhóm OH, do hiệu ứng rút điện tử của vòng thơm nên phân tử oxy không còn giàu điện tử nữa, vì vậy proton không thể tấn công vào để hình thành cation trung gian được, phản ứng ether hóa không thể diễn ra. Để tổng hợp ether hiệu quả, ta phải sử dụng phương pháp tổng hợp của Williamson. Phản ứng được thực hiện bằng cách cho hesperetin phản ứng với dimethylsulfate trong môi trường kiềm. Quy trình đề xuất thực nghiệm:
- Ether hóa hesperetin với dimethyl sulfate và potassium carbonate. - Lọc loại tác chất dư.
- Cô cạn thu sản phẩm thô, tinh chế lại với acetone.