Vì đoạn gen mang đột biến A8344G liên quan đến hội chứng MERRF nằm gần đoạn lặp 9 bp CCCCCTCTA, nên chúng tôi nghiên cứu sự có mặt của hai đột biến này cùng nhau.
3.2.1. Nhân bản đoạn gen từ 8155-8366 bằng PCR
Chúng tôi đã dùng kỹ thuật PCR với mồi xuôi (8155-8175) bắt cặp hoàn toàn với sợi khuôn và mồi ngược (8366-8345) chứa một điểm không bắt cặp với sợi khuôn có trình tự dưới đây để nhân bản đoạn gen 212 bp (8155-8366) trong hệ gen ty thể.
Tên mồi Trình tự
MRAG Fw 5’GGT ATA CTA CGG TCA ATG CTC 3’ (nt 8155-8175) MRAG Rv 5’ TTT CAC TGT AAA GAG GTG TGG G3’ (nt 8366-8345)
Đoạn DNA mà chúng tôi nhân bản là trình tự thường có thể mang: i) đột biến mất đoạn 9 bp nằm ở một trong hai trình tự lặp lại CCCCCTCTA từ vị trí 8272- 8289; ii) đột biến điểm A8344G.
Đoạn gen khi không có đột biến mất đoạn cũng như đột biến A8344G sẽ có chiều dài 212 bp và khi không có đột biến A8344G thì chứa 2 điểm cắt của BanII
(GAGCCC và GGGCCC). Đoạn gen khi được nhân bản bằng PCR và được cắt bằng enzyme BanII sẽ tạo ra 3 đoạn với kích thước là 99 bp, 41 bp và 72 bp. Nếu có đột biến A8344G, với cách thiết kế mồi vừa nêu thì đoạn DNA nhân bản sẽ có thêm một điểm cắt ở đoạn 72 bp (GAGCCC), và khi đó sản phẩm cắt bằng BanII sẽ gồm 4 đoạn với kích thước là 99 bp, 41 bp, 52 bp và 20 bp. Khi có đột biến mất đoạn 9 bp, thì đoạn gen nhân bản chỉ còn 203 bp và nếu được cắt bằng BanII sẽ cho 4 băng với kích thước là 99 bp, 32 bp, 52 bp và 20 bp. Băng 20 bp khó được nhìn thấy trên gel vì kích thước qúa nhỏ nên có thể chạy ra khỏi gel.
Kết quả điện di agarose 2% sản phẩm PCR (hình 10) cho thấy sự xuất hiện của băng DNA với kích thước như mong đợi (203-212 bp) ở các mẫu có DNA tách
từ bệnh nhân, trong khi đó mẫu kiểm tra âm (không chứa DNA) không cho băng DNA nhân bản nào. Như vậy, cặp mồi chúng tôi thiết kế là đặc hiệu cao cho việc nhân bản đoạn DNA có kích thước 212 bp.
Hình 10: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 100 bp; 2: Đối chứng âm (không có khuôn DNA);
3-10:Sản phẩm PCR với DNA khuôn một số bệnh nhân.
Có thể dễ dàng nhận thấy trong số các băng nhân bản có một số băng (đường chạy 6 và 10) chạy nhanh hơn những băng còn lại. Kết quả này được khẳng định chắc chắn hơn khi chúng tôi tái điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide với khả năng tách bạch các băng DNA kích thước nhỏ tốt hơn (hình 11, đường chạy 4 và 5). Kết quả này gợi ý về khả năng các mẫu 6 và 10 có mang đột biến mất đoạn 9 bp.
Hình 11: Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide
Đường chạy 1: Thang chuẩnDNA Low Range, 2-5: Sản phẩm PCR mẫu bệnh nhân
3.2.2. Phát hiện đột biến A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp bằng PCR-RFLP
Sau khi kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 2%, chúng tôi đã tiến hành cắt trực tiếp các sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn BanII, sau đó điện di sản
phẩm trên gel polyacrylamide 15%. Kết quả thu được (hình 12) cho thấy sản phẩm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
212bp
1 2 3 4 5
PCR với mẫu DNA khuôn của các bệnh nhân sau khi cắt bằng BanII cho các băng
có kích thước khác nhau. Các mẫu ở đường chạy 4, 5, 8, 9 cho thấy có 3 băng, theo tính toán lý thuyết có kích thước lần lượt là 99 bp (từ vị trí 8155→8253), 41 bp (từ vị trí 8254→8294) và 72 bp (từ vị trí 8295→8366 ). Còn các mẫu ở đường chạy 3, 6, 7, 10 có 3 băng là 99 bp, 72 bp và một băng ngắn hơn băng 41 bp. Như vậy có thể kết luận đoạn DNA mà chúng tôi nhân bản chỉ có 2 vị trí nhận biết cho enzyme
BanII, chứng tỏ tất cả các mẫu kiểm tra đều không có đột biến điểm A8344G.
Kết quả này cũng cho thấy các mẫu ở đường chạy 3, 6, 7 và 10 xảy ra hiện tượng mất đoạn và sự mất đoạn này nằm ở băng 41 bp (từ vị trí 8254→8294), băng này chỉ còn 32 bp theo như tính toán lý thuyết.
Hình 12: Kết quả điện di sản phẩm PCR cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide
Đường chạy 1: thang chuẩn DNA Low Range, 2: Sản phẩm PCR không cắt BanII, 3→10: Sản phẩm PCR từ mẫu DNA của các bệnh nhân được cắt bằng enzyme BanII
Tất cả các mẫu nghi ngờ đều không còn băng 41 bp nên đột biến mất đoạn này ở dạng homoplasmy ở tất cả các trường hợp, có nghĩa là đột biến mất đoạn có mặt ở tất cả các bản copy của DNA ty thể.
Để khẳng định tính chất di truyền theo dòng mẹ của các gen trên hệ gen ty thể. Chúng tôi đã kiểm tra phổ băng PCR-RFLP của 4 gia đình (ký hiệu I, II, III và IV) có bệnh nhân nghi ngờ mất đoạn. Kết quả điện di ở hình 13 cho thấy sản phẩm PCR với mẫu DNA khuôn của bố bệnh nhân của cả 4 gia đình sau khi cắt bằng
BanII có 3 băng với kích thước 99 bp, 72 bp và 41 bp giống như mẫu bình thường
(hình 13, đường chạy 5, 10, 15 và 18). Trong khi đó sản phẩm PCR với DNA khuôn của mẹ bệnh nhân ở cả 4 gia đình được cắt bằng BanII đều cho 3 băng DNA có kích thước 99 bp, 72 bp và 32 bp (hình 13, đường chạy 4, 9, 14, 17) giống như mẫu bệnh nhân nghi ngờ đột biến mất đoạn (hình 13, đường chạy 3, 8, 13 và 16). Kết quả này
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 41 72 99 bp p 212
chứng tỏ bố bệnh nhân của cả 4 gia đình đều không mang đột biến mất đoạn, còn bệnh nhân và mẹ bệnh nhân của 4 gia đình đều mang đột biến mất đoạn.
Hình 13: Kết quả điện di sản phẩm PCR ở một số gia đình bệnh nhân cắt bằng BanII trên gel polyacrylamide
Đường chạy 1, 6 và 11: Thang chuẩn DNA Low Range; 2, 7 và 12: Sản phẩm PCR với khuôn DNA của bệnh nhân I , II, III và IV không cắt BanII; 3, 8, 13 và 16: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của bệnh nhân gia đình I, II, III và IV được cắt bằng BanII; 4, 9, 14 và 17: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của mẹ bệnh nhân gia đình I, II, III và IV được cắt bằng BanII; 5, 10, 15 và 18: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của bố bệnh nhân gia đình I, II, III và IV được cắt bằng BanII.
Để có thêm bằng chứng về di truyền từ mẹ sang con của đột biến mất đoạn 9 bp, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra phổ băng PCR đoạn gen 212 bp của hai gia đình bệnh nhân khác, mỗi gia đình có 2 con. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 15% (Hình 14) cho thấy băng DNA nhân bản ở mẫu các con và mẹ bệnh nhân đều chạy nhanh hơn băng DNA nhân bản ở mẫu bố bệnh nhân. Kết quả này một lần nữa bổ sung tính chất di truyền theo dòng mẹ của đột biến mất đoạn 9 bp.
11 12 13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 212 99 72 41 bp p 6 7 8 9 10 212 99 72 41 bp p
3.2.3. Phân tích trình tự mất đoạn 9 bp trên gen ty thể
Để khẳng định chắc chắn những kết luận do phương pháp PCR-RFLP thu được trên đây, chúng tôi tiến hành nhân dòng đoạn DNA được nhân bản bằng PCR vào vector pGEM-T và giải trình tự đoạn DNA kích thước 212 bp đối với sáu gia đình (I, II, III, IV, V, VI). Kết quả được minh họa với thành viên gia đình III.
Sản phẩm PCR được gắn với vector pGEM-T và được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào được nuôi trên đĩa thạch LB có 50-100 µg/ml
ampicillin, cơ chất X-gal và chất cảm ứng IPTG. Sau khi được nuôi qua đêm ở 37oC, các khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng xuất hiện. Các khuẩn lạc màu trắng theo lý thuyết là chứa vector tái tổ hợp (hình 15).
Hình 15: Kết quả biến nạp hỗn hợp gắn giữa sản phẩm PCR và vector pGEM-T Hình 14: Kết quả điện di sản phẩm PCR hai gia đình bệnh nhân trên gel polyacrylamide
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA Low Range; 2: Đối chứng âm (không có khuôn DNA); 3, 7: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của bệnh nhân gia đình V và VI; 4, 8: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của anh trai bệnh nhân gia đình V và em trai bệnh nhân gia đình VI; 5, 9: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tương ứng của mẹ bệnh nhân gia đình V và VI; 6, 10: Sản phẩm PCR với
khuôn DNA tương ứng của bố bệnh nhân gia đình V và VI.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Để kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích (đoạn 212 bp) trong vector tái tổ hợp ở các khuẩn lạc trắng, chúng tôi chọn một khuẩn lạc xanh và một số khuẩn lạc trắng rồi tiến hành PCR sử dụng hai cặp mồi: i) Cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv có trình tự nằm trên vector pGEM-T với khoảng cách giữa hai mồi là 296 bp; ii) Cặp mồi MRAGF và MRAGR đặc hiệu cho đoạn DNA 212 bp chèn vào vector pGEM-T.
Kết quả điện di (hình 16) cho thấy sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc xanh với cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv cho băng DNA có kích thước khoảng 0,3 kb mà theo tính toán lý thuyết là 296 bp (hình 16B, đường chạy 7), còn với cặp mồi MRAGF và MRAGR không cho băng DNA nào (hình 16A, đường chạy 2). Sản phẩm PCR với các khuẩn lạc trắng khi sử dụng cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv (hình16B, đường chạy 8, 9, 10) cho băng DNA có kích thước khoảng 0,5 kb mà theo tính toán lý thuyết là 508 bp, còn với cặp mồi MRAGF và MRAGR (hình 16A, đường chạy 3, 4, 5) cho băng DNA có kích thước khoảng 212 bp. Như vậy, chúng tôi đã thu được các khuẩn lạc trắng có vector tái tổ hợp mang đoạn DNA mong muốn.
A B
A: PCR với mồi MRAGF và MRAGR, B: PCR với cặp mồi pUC19F và pUC19R Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 100 bp; 6: Thang chuẩn DNA 1 kb; 2, 7: Sản phẩm
PCR từ khuẩn lạc xanh; 3, 4, 5 - 8, 9, 10: Sản phẩm PCR từ khuẩn lạc trắng tương ứng của mẫu bệnh nhân, mẹ và bố bệnh nhân ở gia đình III.
Từ các khuẩn lạc thu được, một số khuẩn lạc trắng được chọn ngẫu nhiên để nuôi trong môi trường LB lỏng, chuẩn bị cho bước tinh sạch plasmid. DNA được tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở 3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo
Hình 16: Kết quả điện di sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc
508 296 6 7 8 9 10 bp 212 1 2 3 4 5 bp
thành do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch thẳng khi cả hai mạch DNA đều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc không gian gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối cùng là mạch vòng.
Kết quả điện di ở hình 17 cho thấy sự xuất hiện của một số băng có kích thước lớn hơn là do hiện tượng plasmid tồn tại ở các dạng xoắn và siêu xoắn khác nhau vì vậy có độ di động điện di khác nhau như vẫn thường gặp ở các loại plasmid dạng mạch vòng khác. Chế phẩm plasmid thu được có độ tinh sạch cao, không lẫn RNA và có kích thước băng đúng như tính toán lý thuyết (lớn hơn 3 kb). Trong đó băng chạy trước sáng và rõ nét chứng tỏ lượng DNA plasmid thu được tồn tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng và rất ít dạng đứt gãy. Những plasmid tái tổ hợp này được tách chiết với lượng lớn và đủ độ tinh sạch để tiến hành xác định trình tự.
Chúng tôi đã tiến hành giải trình tự đoạn gen đích trong vector tái tổ hợp thu được ở trên và so sánh trình tự vừa đọc được với trình tự gốc chuẩn rCRS (mã số J01415.2 trong Ngân hàng gen). Kết quả so sánh trình tự đoạn gen (Hình 18) cho thấy đoạn gen từ vector tái tổ hợp pGEM-T của bố bệnh nhân có độ tương đồng 99,53% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể công bố trên GenBank [44]. Chỉ có một nucleotide (C) vị trí 193 là không khớp với nucleotide (A) ở vị trí 8347 (trên genome ty thể hoàn chỉnh), nguyên nhân của sai khác này là do chúng tôi chủ động thay thế nucleotide T bằng G trong mồi MRAGRv khi thiết kế. Ngoài ra, kết quả cũng cho thấy đoạn gen đích của mẫu bố bệnh nhân chứa đầy đủ 2 trình tự lặp lại 9 bp là CCCCCTCTACCCCCTCTA.
Hình 17: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch plasmid trên gel agarose
1 2 3 4
Đường chạy 1: Thang chuẩn DNA 1 kb; 2, 3, 4: plasmid tinh sạch gia đình bệnh nhân III.
Tuy nhiên, trình tự đoạn gen của bệnh nhân và người mẹ chỉ có độ tương đồng 95,3% so với trình tự chuẩn tương ứng của hệ gen ty thể công bố trên GenBank, do mất đi 9 nucleotide CCCCCTCTA so với trình tự chuẩn, ngoài ra có sự sai khác một nucleotide (C thay cho A ở vị trí 184 trong đoạn gen được nhân lên) do cách thiết kế mồi ban đầu của chúng tôi.
Dưới đây là một phần trình tự tự nucleotide và tín hiệu huỳnh quang thu được từ máy CEQ8000 khi xác định trình tự mẫu gia đình bệnh nhân III.
A. Bố Bệnh nhân
Hình 18: Kết quả so sánh trình tự đoạn gen bệnh nhân, mẹ bệnh nhân và bố bệnh nhân gia đình III với trình tự chuẩn hệ gen ty thể công bố trên GenBank
B. Mẹ Bệnh nhân
C. Bệnh nhân
Hình 19: Kết quả xác định trình tự của đoạn gen đích của gia đình III (A, B, C)
Như vậy, kết quả giải trình tự đoạn DNA (8155-8366) trên hệ gen ty thể hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích bằng PCR-RFLP. Tuy nhiên, việc xác định trình tự giúp chúng tôi khẳng định chính xác đoạn nulcleotide bị mất.
Áp dụng phương pháp đã nêu ở trên (PCR-RFLP kết hợp với việc xác định trình tự, chúng tôi đã phát hiện 23 trường hợp mất đoạn 9 bp (Bảng 10, Phụ lục 2) trong tổng số 72 mẫu nghiên cứu, chiếm tỷ lệ 31,9~32%.
Bảng 10: Danh sách bệnh nhân bị đột biến mất đoạn 9 bp
STT Bệnh nhân Ghi chú STT Bệnh nhân
1 Nguyễn Đình N.
Gia đình I
7 Phạm Thanh H.
Nguyễn Đình Nh. 8 Nguyễn Thị Phương N. Đỗ Thị Gi. 9 Đào Thái S.
2 Hoàng Thị Như Q.
Gia đình II
10 Vũ Qúy M. Hoàng Văn T. 11 Đỗ Trường P. Nguyễn Thị H. 12 Lê Doãn Xuân Tr. 3 Lê Mai L.
Gia đình III
13 Trần Thanh B. Bùi Thị D. 14 Trần An N. Lê Xuân S. 15 Hà Việt H. 4 Nguyễn Thị T.
Gia đình IV
16 Trần Đình Việt D. Nguyễn Mạnh H. 17 Phạm Nhật Q. Nguyễn Hồng Đ. 18 Đinh Viê ̣t N. 5 Nguyễn Văn Đ.
Gia đình V
19 Nguyễn Văn T. Ngô Thị Ng. 20 Nguyễn Kim H. Nguyễn Minh Đ. 21 Nguyễn Hoàng A. Nguyễn Văn Đi. 22 Trần Văn H. 6 Nguyễn Thị Phương Kh. Gia đình VI 23 Nguyễn Mạnh D. Nguyễn Thành Đ. Nguyễn Đức Th. Lê Thị K.
Như vậy tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp giữa vùng COII và tRNALys ở các bệnh nhân Việt Nam nghi ngờ hội chứng cơ não ty thể là tương đối cao so với những người khỏe mạnh (chiếm tỷ lệ 20%) như được báo cáo trong nghiên cứu trước đây [18]. Kết quả này phần nào cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu về tần suất xuất hiện sự mất đoạn 9 bp trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân người Đài Loan mắc hội chứng MELAS và MERRF là 47% so với người khỏe mạnh là 21% [22].
Các nghiên cứu trước đây cũng đã cho rằng có sự thiếu ổn định của vùng gen COII/tRNALys trong hệ gen ty thể ở các bệnh nhân bị bệnh ty thể và là điểm nóng cho sự mất đoạn [33], mặc dầu vùng này của ty thể vốn được xem là một vùng không mã hóa cho protein hay enzyme nào. Do đó, có thể nó không phải là một đột biến gây nên bệnh tật. Nhưng tỷ lệ đột biến mất đoạn cao trong những bệnh nhân có biểu hiện rối loạn hoạt động ty thể, khiến chúng tôi nhận định hai khả năng: thứ nhất, ở bệnh nhân bị rối loạn hoạt động ty thể thì quá trình sao chép của gen ty thể bị lỗi và gây ra sự