Sau khi nuôi cấy trên đĩa thạch, một khuẩn lạc trắng (mang plasmid biến nạp mong muốn) được lấy để nuôi trong 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370
C qua đêm. Dung dịch có chứa khuẩn lạc nuôi cấy được dùng để thu nhận plasmid tinh sạch.
5 ml dung dịch tế bào vi khuẩn trên được đem ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút, lớp dịch nổi được loại bỏ và chỉ thu tủa tế bào. Tủa tế bào được hòa trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM , pH 8) đã được làm lạnh và trộn hỗn hợp cho kỹ đến khi tủa tan hoàn toàn rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Cho 200 µl dung dịch II bao gồm SDS 10% và NaOH 200 mM vào dung dịch trên, trộn đều hỗn hợp bằng cách đảo ống 4-6 lần và để trên đá trong 5 phút trong thời gian này màng tế bào bị phá vỡ giải phóng plasmid. Tiếp theo, 150 µl dung dịch III (kali acetate 3 M, pH 5,5) lại được thêm vào hỗn hợp và trộn đều bằng cách đảo ống 4-6 lần rồi để trên đá trong 5 phút để trung hòa dung dịch. Sau đó, hỗn hợp được đem ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, thu dịch nổi và loại bỏ tủa (nên tránh hút lẫn tủa). DNA được kết tủa bằng cách thêm 70% thể tích isopropanol vào hỗn
hợp vừa thu được và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, DNA tủa ở dưới đáy ống sẽ được thu lại. Tủa vừa thu được đem hòa trong 50 µl H2O có bổ sung 1 µl RNase và ủ ở 370C trong 15 phút. Tiếp đó cho vào đó một thể tích tương đương phenol: chloroform: Isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25 : 24 : 1 về thể tích), trộn kỹ để protein tủa hoàn toàn, tiếp đến ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi. Hỗn hợp vừa thu được này sau đó được thêm vào 1/10 thể tích CH3COOK 3 M, pH 5,2 và 2,5 thể tích ethanol 100% và để ở -200
C trong 20 phút cho DNA kết tủa hoàn toàn, rồi ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Tủa DNA thu được ở bước này được rửa 2 lần bằng ethanol 70%, sau đó được làm khô tự nhiên trong 10 phút. Cuối cùng DNA được hòa tan vào 50-100 µl H2O, bảo quản ở -200C đến khi dùng.
