PCR nhân bản các đoạn gen của ty thể được tiến hành với thành phần phản ứng (25 µl) gồm: 20-50 ng DNA khuôn; 10 pmole mồi xuôi và 10 pmole mồi ngược; Taq DNA polymerase 5 đơn vị/µl; dNTP 0,2 mM; đệm Taq DNA
polymerase và nước cất loại ion vô trùng theo các tỷ lệ nêu trong bảng 5.
PCR được thực hiện với chế độ nhiệt 94oC, 2 phút để khởi động nóng ban đầu, tiếp theo 35 chu kỳ với 94oC, 10 giây để biến tính, 58o
C (được lựa chọn tùy thuộc nhiệt độ tách chuỗi Tm của mồi), 1 phút để gắn mồi và 72oC, 30 giây để kéo
dài chuỗi, ở cuối 35 chu kỳ sản phẩm được giữ tiếp ở 72oC trong 7 phút, giữ ở 4 oC.
Bảng 5: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn mtDNA (8155-8366)
STT Thành phần Thể tích
1 Khuôn DNA 1 µl
2 Mồi xuôi 10 pmole/µl 1 µl
3 Mồi ngược 10 pmole/µl 1 µl
4 Taq Polymerase 5 đơn vị/µl 0,5 µl 5 Đệm Taq Polymerase 10X 2,5 µl
6 Hỗn hợp dNTP 2 mM 2,5 µl
7 Nước cất loại ion vô trùng 16,5 µl
Tổng thể tích 25 µl
Hình 8: Chu kỳ nhiệt của PCR để nhân bản đoạn mtDNA (8155-8366)
Sản phẩm PCR sau đó được phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide, được nhuộm bằng EtBr và chụp ảnh dưới nguồn ánh sáng tử ngoại.
2.2.7. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP)
Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng nhận biết một trình tự đặc trưng 4-8 nucleotide và cắt DNA mạch đôi tại một vị trí xác định. Vị trí cắt này có mối quan hệ với vị trí của trình tự nhận biết của enzyme. Sản phẩm PCR được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII để sàng lọc đột biến A8344G.
Enzyme BanII có trình tự nhận biết là :
Do đó BanII cắt đứt liên kết phosphodieste giữa Y và C tại ngay trình tự
nhận biết đó (GRGCY/C).
Phản ứng cắt được thực hiện với các thành phần như nêu ở bảng 6 và được giữ ở 37oC, trong 14 giờ. Sản phẩm cắt sau đó được điện di trên gel polyacrylamide 15%.
5'...G R G C Y↓C…3' 3'...C↑Y C G R G...5'
Trong đó:
Bảng 6: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn BanII
STT Thành phần Thể tích
1 Sản phẩm PCR 15 µl
2 Enzyme BanII 10 đơn vị/µl 1 µl
3 Đệm Tango 2X 2 µl
4 Nước cất loại ion vô trùng 13 µl
Tổng thể tích 31 µl
Phân tích đột biến gen A 3243G được thực hiện theo phương pháp PCR- RFLP cải tiến [3]. Sản phẩm PCR được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn HeaIII để sàng lọc đột biến A3243G. Phản ứng cắt được thực hiện với các thành phần như nêu ở bảng 7 và được giữ ở 37oC, trong 14 tiếng. Sản phẩm cắt sau đó được điện di trên gel polyacrylamide 15%.
Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn HeaIII
STT Thành phần phản ứng Thể tích
1 Sản phẩm PCR 20 µl
2 Đệm R 10X 3 µl
3 Enzyme HeaIII 10 đơn vị/µl 2 µl 4 Nước cất loại ion, vô trùng 5 µl
Tổng thể tích 30 µl