Kéo dài mồi dựa trên đánh dấu huỳnh quang sử dụng VentR (exo-) DNA polymerase để loa ̣i trừ sự hình thành heteroduplex cũng là một trong các phương pháp được dụng trong phát hiện đột biến điểm. Các DNA homoduplex đươ ̣c đánh dấu và phân cắt b ằng enzyme giới hạn, phân tách trên máy giải trình tự DNA tự đô ̣ng.Tỷ lệ mtDNA đô ̣t biến được xác đi ̣nh theo mâ ̣t đô ̣ huỳnh quang của các đoạn DNA đột biến và không đô ̣t biến.
Kỹ thuật SSCP (Single-Stranded Conformational Polymorphism) với nguyên tắc là trong điều kiện điện di không biến tính, các mạch đơn DNA sẽ có một cấu trúc nhất định tùy theo trình tự của nó. Cấu hình này được xác định bởi các liên kết nội phân tử. Các cấu hình sẽ khác nhau ngay cả khi chỉ khác biệt một nucleotide. Sự khác biệt này dẫn đến sự khác biệt về khả năng di chuyển trong gel polyacrylamide. Phương pháp này có thể áp dụng để sàng lọc đột biến điểm chưa biết ở bê ̣nh nhân nghi ngờ rối loa ̣n mtDNA, đi ̣nh lượng mtDNA đô ̣t biến. Đầu tiên, thực hiện PCR để khuếch đa ̣i đoa ̣n DNA xung quanh vị trí đột biến (khoảng 200- 350 bp, tốt nhất DNA kích thước khoảng 150 bp) với một mồi có gắn phóng xạ (đánh dấu dATP-P32 hoặc huỳnh quang) và một mồi không gắn phóng xạ để tạo nên đoạn DNA sợi kép ngắn. Sản phẩm PCR được biến tính thành sợi đơn và phân tách bằng điện di trên gel polyacrylamide không biến tính . Gel này cho phép các sợi đơn tái tạo lại cấu trúc, hình thành cấu trúc thứ cấp khác nhau. Những mảnh DNA sợi đơn khác nhau sẽ hình thành tập hợp những cấu trúc thứ cấp và chính vì thế tạo nên kiểu băng điện di khác nhau trên gel . Phân tích tự đô ̣ng bằng điê ̣n di ma o quản hoă ̣c bằng autoradiography . Trình tự khác nhau làm thay đổi cấu trúc DNA, do đó các băng mang đô ̣t biến được phân biê ̣t bởi sự di trú khi điê ̣n di . So sánh với đối chứng, xác định trình tự nucleotide.
Chip DNA hoặc DNA microarray là một kỹ thuật mới để phát hiện các đột biến đặc hiệu với tốc độ rất nhanh, chính xác dựa trên cơ sở phân tích đột biến bằng
vi tính. Để sản xuất các chip DNA, các oligonucleotide đóng vai trò của các đoạn dò (probe) được máy cài lên một phiến kính nhỏ. Mỗi phiến kính như vậy với diện tích khoảng 1 cm2 có thể chứa từ hàng trăm đến hàng ngàn loại oligonucleotide khác nhau. Các oligonucleotide này gồm các DNA có trình tự bình thường và các DNA có trình tự mang các đột biến gây bệnh đã biết. DNA của một đối tượng nào đó được gắn huỳnh quang và cho lai với các oligonucleotide trên phiến kính để xác định xem chúng lai với oligonucleotide bình thường hay đột biến. Mẫu lai được phân tích trên máy vi tính để xác định DNA của đối tượng là bình thường hay mang loại đột biến cụ thể nào.
Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5 (cyanine), streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P,
33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin, và nhuộm vàng/bạc. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất. Cy3 là một chất nhuộm huỳnh quang tan trong nước thuộc họ cyanine có bước sóng kích thích/bước sóng phát huỳnh quang cực đại là 550/570 nm. Cy3 thường được tổng hợp với các nhóm phản ứng ở một hoặc cả hai vị trí của nitơ để có thể tương tác với cả axit nucleic lẫn protein
Năm 2009, Du và cộng sự [14] đã thử nghiệm biochip trên 7 bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng được chẩn đoán MELAS, 5 bệnh nhân MERRF, 1 trường hợp nghi nghờ MERRF và 25 người khỏe mạnh. Sử dụng DNA khuôn gắn chất huỳnh quang Cy5, sau đó khuếch đại bằng PCR, rồi tiến hành lai với mẫu dò-31 mẫu dò được thiết kế để sàng lọc 31 loại đột biến điểm gây nên MELAS và MERRF, mỗi cặp mẫu dò cụ thể cho một đột biến nhất định có trình tự giống hệt ngoại trừ một nucleotide thay thế nằm gần giữa trình tự. Các tín hiệu huỳnh quang từ tất cả các điểm trên biochip được bắt giữ bởi một đầu đọc tín hiệu huỳnh quang (GenePix 4000B, Axon Instruments, Inc.) tại bước sóng 635 nm cho Cy5 và phân tích bởi phần mềm GenePix Pro 4.0. Kết quả cho thấy tất cả bệnh nhân chẩn đoán MELAS có đột biến A3243G trên tARNLeu (heteroplasmy), trong những bệnh nhân MERRF có 4 trường hợp là đột biến A8344G trên tARNLys
(homoplasmy), 1 trường hợp T8356C trên tARNLys (heteroplasmy). Không ai trong số người khỏe mạnh mang những đột biến này.
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu: mẫu máu của 72 bệnh nhân được chẩn đoán mang dấu hiệu bệnh ty thể và mẫu máu của bố mẹ bệnh nhân đó do Bệnh viện Nhi Trung ương cung cấp (phụ lục 1). Các mẫu máu được bảo quản ở -20oC.
Hóa chất gồm: các cặp mồi để sàng lọc các loại đột biến điểm trên mtDNA và cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv (bảng 3) được mua từ hãng Invitrogen và Fermentas, thang chuẩn DNA, dNTP và các enzyme được mua từ hãng Fermentas; bộ kit tách chiết DNA được mua từ hãng Qiagen, kit pGEM-T được mua từ hãng Invitrogen; Taq DNA polymerase của Hãng Enzynomics và Protein cung cấp, hóa
chất cho giải trình tự của hãng Beckman Coulter. Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh sạch cho nghiên cứu sinh học phân tử.
Hai loại cặp mồi để kiểm tra sự có mặt của 2 loại đột biến điểm A3243G và A8344G trên mtDNA gây nên các hội chứng tương ứng là MELAS và MERRF (bảng 3). Trong đó, cặp mồi MRAGFw và MRAGRv được sử dụng để sàng lọc đồng thời hai loại đột biến là A8344G và đột biến mất đoạn 9 bp CCCCCTCTA.
Bảng 3: Trình tự các cặp mồi dùng trong PCR
STT Tên mồi Trình tự mồi
1 Mt Fw 5’-CAAGAGAAATAAGGCTTACTTC- 3’ Mt Rv 5’-GGAGTAGGAGGTTAGCCATGGG-3’ 2 MRAGFw 5’-GGTATACTACGGTCAATGCTC- 3’ MRAGRv 5’ -TTTCACTGTAAAGAGGTGTGGG-3’
Các cặp mồi được thiết kế để bắt cặp đặc hiệu với đoạn DNA cần nhân lên, trong đó có những mồi chứa nucleotide không ghép cặp (mismatch) để tạo thêm hoặc giảm bớt vị trí cắt của các enzyme giới hạn, từ đó tạo nên các băng điện di khác nhau ở mẫu bệnh nhân bị đột biến và không đột biến.
Thiết bị máy móc chính gồm: máy điện di ngang và điện di đứng, máy PCR (Eppendorf), máy soi và chụ ảnh gel (BioRad), máy đo mật độ hấp thụ quang học (Nano Drop), máy đọc trình tự CEQ 8000 ( Beckman Coulter) và nhiều thiết bị cần thiết khác.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách DNA tổng số từ máu theo kit của Qiagen
Mẫu máu bệnh phẩm được xử lý để thu DNA tổng số theo quy trình như sau: Một ống 1,5 ml sạch được cho lần lượt 20 µl protease Qiagen và 200 µl mẫu máu, sau đó được bổ sung 200 µl đệm AL và 4 µl RNase 10 mg/ml. Hỗn hợp được trộn đều bằng máy vortex trong 15 giây để thu được một dung dịch đồng nhất và được ủ ở 56oC trong 10 phút. Sau đó hỗn hợp được ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Tiếp theo, hỗn hợp được bổ sung 200 µl ethanol 100%, trộn đều và ly tâm nhẹ 3.000 vòng/phút. Dung dịch trong ống được chuyển vào cột Qiagen, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút và dịch đi qua cột được loại bỏ. Cột được bổ sung 500 µl AW1, và ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút, sau đó dịch đi qua cột bị loại bỏ. Cột tiếp tục được cho thêm 500 µl AW2, ly tâm 14.000 vòng/phút trong 2 phút và dịch đi qua cột bị loại bỏ. Cột được chuyển sang một ống 1,5 ml sạch khác và được bổ sung 150 µl nước cất vô trùng và để yên trong 1 phút, sau đó được ly tâm 8.000 vòng/phút trong 1 phút. Dịch đi qua cột là DNA tổng số. Mẫu được bảo quản ở −20oC. Sản phẩm DNA tổng số được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% và được đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại bằng máy NanoDrop để kiểm tra độ tinh sạch của sản phẩm.
2.2.2. Tách plasmid theo phương pháp của Sambrook và Russell [32]
Sau khi nuôi cấy trên đĩa thạch, một khuẩn lạc trắng (mang plasmid biến nạp mong muốn) được lấy để nuôi trong 5 ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc ở 370
C qua đêm. Dung dịch có chứa khuẩn lạc nuôi cấy được dùng để thu nhận plasmid tinh sạch.
5 ml dung dịch tế bào vi khuẩn trên được đem ly tâm 6.000 vòng/phút trong 10 phút, lớp dịch nổi được loại bỏ và chỉ thu tủa tế bào. Tủa tế bào được hòa trong 100 µl dung dịch I (Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM , pH 8) đã được làm lạnh và trộn hỗn hợp cho kỹ đến khi tủa tan hoàn toàn rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Cho 200 µl dung dịch II bao gồm SDS 10% và NaOH 200 mM vào dung dịch trên, trộn đều hỗn hợp bằng cách đảo ống 4-6 lần và để trên đá trong 5 phút trong thời gian này màng tế bào bị phá vỡ giải phóng plasmid. Tiếp theo, 150 µl dung dịch III (kali acetate 3 M, pH 5,5) lại được thêm vào hỗn hợp và trộn đều bằng cách đảo ống 4-6 lần rồi để trên đá trong 5 phút để trung hòa dung dịch. Sau đó, hỗn hợp được đem ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, thu dịch nổi và loại bỏ tủa (nên tránh hút lẫn tủa). DNA được kết tủa bằng cách thêm 70% thể tích isopropanol vào hỗn
hợp vừa thu được và ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút, DNA tủa ở dưới đáy ống sẽ được thu lại. Tủa vừa thu được đem hòa trong 50 µl H2O có bổ sung 1 µl RNase và ủ ở 370C trong 15 phút. Tiếp đó cho vào đó một thể tích tương đương phenol: chloroform: Isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25 : 24 : 1 về thể tích), trộn kỹ để protein tủa hoàn toàn, tiếp đến ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút và thu dịch nổi. Hỗn hợp vừa thu được này sau đó được thêm vào 1/10 thể tích CH3COOK 3 M, pH 5,2 và 2,5 thể tích ethanol 100% và để ở -200
C trong 20 phút cho DNA kết tủa hoàn toàn, rồi ly tâm 14.000 vòng/phút trong 20 phút ở 40C. Tủa DNA thu được ở bước này được rửa 2 lần bằng ethanol 70%, sau đó được làm khô tự nhiên trong 10 phút. Cuối cùng DNA được hòa tan vào 50-100 µl H2O, bảo quản ở -200C đến khi dùng.
2.2.3. Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại
Phương pháp định lượng DNA dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260 nm (A260) của các phân tử DNA. Từ giá trị mật độ quang ở bước sóng 260 nm của các mẫu, với hệ số A260 = 1 tương đương với 50 µg/ml để tính ra hàm lượng DNA có trong mẫu. Ngoài ra, tỉ số A260/A280 được sử dụng để đánh giá độ sạch của chế phẩm. Hệ số nằm trong khoảng 1,8-2,0 chứng tỏ chế phẩm DNA có độ sạch cần thiết (ít lẫn RNA và protein).
2.2.4. Điện di DNA trên gel agarose
Các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường trung tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường chúng sẽ di chuyển về cực dương. Mức độ di chuyển của các phân tử DNA trong điện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước của chúng và nồng độ gel. Phân tử kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn phân tử kích thước lớn. Gel agarose 1-2% được chuẩn bị trong đệm TAE với nồng độ EDTA 1-2 mM để tránh sự phân cắt DNA bởi nuclease. Mẫu DNA được trộn với đệm mẫu chứa sẵn 50 g/ml ethidium bromide. Điện di được tiến hành với điện thế ổn định khoảng 10 volt/cm gel và chạy trong vòng 25-30 phút. Sau khi kết thúc điện di bản gel được lấy ra soi dưới ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp ảnh gel Doc (Bio-Rad). Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dễ dàng chúng ở trong gel. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuốc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suốt quá trình điện di hoặc ở giai đoạn cuối có ưu thế rõ rệt.
2.2.5. Điện di DNA trên gel polyacrylamide
Gel polyacrylamide được trùng hợp từ acrylamide và bisacrrylamide với sự có mặt của ammonium persulphate và TEMED. Phản ứng trùng hợp chuỗi được bắt đầu trong đó các acrylamide monomer được polymer hóa (trùng hợp) thành một chuỗi dài. Khi bisacrylamide được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo (cross-linking) để tạo thành dạng gel. Kích thước lỗ gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa. Gel polyacrylamide 15% được tổng hợp với các thành phần như trong bảng 4:
Bảng 4: Thành phần bản gel điện di polyacrylamide
STT Thành phần Thể tích 1 Acrylamide 30% 2 ml 2 TBE 5X 1 ml 3 APS 10% 35 µl 4 TEMED 3,5 µl 5 Nước cất khử trùng 1,965 ml Tổng thể tích 5,0035 ml
Sản phẩm nhân bản gen bằng PCR sau khi được cắt bằng enzyme giới hạn được trộn với đệm mẫu (tổng thể tích là 15 µl) và tra vào đường chạy điện di trong đệm TBE 0,5X với điện thế ổn định 10 vol/cmgel cho tới khi vạch chỉ thị màu cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại. Gel được nhuộm bằng EtBr hòa trong nước, sau khoảng 5 phút, bản gel được lấy ra, rửa dưới vòi nước và soi dưới tia ánh sáng tử ngoại của máy soi chụp gel IQ5 (Bio-Rad), các băng gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền gel màu đen.
2.2.6. Nhân bản đoạn gen bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
PCR nhân bản các đoạn gen của ty thể được tiến hành với thành phần phản ứng (25 µl) gồm: 20-50 ng DNA khuôn; 10 pmole mồi xuôi và 10 pmole mồi ngược; Taq DNA polymerase 5 đơn vị/µl; dNTP 0,2 mM; đệm Taq DNA
polymerase và nước cất loại ion vô trùng theo các tỷ lệ nêu trong bảng 5.
PCR được thực hiện với chế độ nhiệt 94oC, 2 phút để khởi động nóng ban đầu, tiếp theo 35 chu kỳ với 94oC, 10 giây để biến tính, 58o
C (được lựa chọn tùy thuộc nhiệt độ tách chuỗi Tm của mồi), 1 phút để gắn mồi và 72oC, 30 giây để kéo
dài chuỗi, ở cuối 35 chu kỳ sản phẩm được giữ tiếp ở 72oC trong 7 phút, giữ ở 4 oC.
Bảng 5: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn mtDNA (8155-8366)
STT Thành phần Thể tích
1 Khuôn DNA 1 µl
2 Mồi xuôi 10 pmole/µl 1 µl
3 Mồi ngược 10 pmole/µl 1 µl
4 Taq Polymerase 5 đơn vị/µl 0,5 µl 5 Đệm Taq Polymerase 10X 2,5 µl
6 Hỗn hợp dNTP 2 mM 2,5 µl
7 Nước cất loại ion vô trùng 16,5 µl
Tổng thể tích 25 µl
Hình 8: Chu kỳ nhiệt của PCR để nhân bản đoạn mtDNA (8155-8366)
Sản phẩm PCR sau đó được phân tách bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide, được nhuộm bằng EtBr và chụp ảnh dưới nguồn ánh sáng tử ngoại.
2.2.7. Kỹ thuật PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP)
Enzyme giới hạn là các endonuclease có khả năng nhận biết một trình tự đặc trưng 4-8 nucleotide và cắt DNA mạch đôi tại một vị trí xác định. Vị trí cắt này có mối quan hệ với vị trí của trình tự nhận biết của enzyme. Sản phẩm PCR được cắt trực tiếp bằng enzyme giới hạn BanII để sàng lọc đột biến A8344G.
Enzyme BanII có trình tự nhận biết là :
Do đó BanII cắt đứt liên kết phosphodieste giữa Y và C tại ngay trình tự
nhận biết đó (GRGCY/C).
Phản ứng cắt được thực hiện với các thành phần như nêu ở bảng 6 và được giữ ở 37oC, trong 14 giờ. Sản phẩm cắt sau đó được điện di trên gel polyacrylamide 15%.