Trong nghiên cứu này, trình tự đoạn gen đặc hiệu cho vùng trình tự mất đoạn 9 bp được đọc trên hệ thống máy giải trình tự CEQ-8000 của Beckman Coulter. Cụ thể, PCR được tiến hành qua hai bước: bước PCR thông thường để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc và bước PCR cho xác định trình tự.
Plasmid tinh sạch được sử dụng làm khuôn cho PCR thông thường (PCR lần 1) với cặp mồi pUC19Fw và pUC19Rv (có trình tự nằm trên vector pGEM-T) để nhân lên một đoạn DNA có chứa phần cần đọc trình tự nucleotide. Sản phẩm PCR lần 1 được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%. Sau đó, sản phẩm PCR lần 1 được làm khuôn cho PCR giải trình tự (PCR lần 2) để tạo thành tập hợp các mạch có kích thước khác nhau. Thành phần của PCR lần 2 có những đặc điểm khác so với PCR lần 1: chỉ có một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngược) và có thêm ddNTP được đánh dấu huỳnh quang. Do 4 loại ddNTP trong BigDye được đánh dấu huỳnh quang bằng 4 màu khác nhau nên chỉ cần tiến hành PCR trong một eppendorf. PCR lần 2 được tiến hành với thành phần như bảng 9 và điều kiện nhiệt: 96oC–2 phút để khởi động nóng ban đầu; tiếp theo 30 chu kỳ: 96oC–20 giây, 50oC–20 giây, 60oC–4 phút; ở cuối 30 chu kỳ sản phẩm được giữ tiếp ở 60oC trong 2 phút và giữ ở 4o
C.
Bảng 9 : Thành phần phản ứng PCR lần 2
STT Thành phần Lƣợng
1 DNA template 0,5 µl
2 Primer pUC19 reverse 1 µl
3 DTCS Master Mix 8 µl
4 H2O 10,5 µl
Sản phẩm PCR lần 2 được xử lý để chuẩn bị mẫu cho máy giải trình tự. Các bước tiến hành như sau: 5 µl dung dịch làm ngừng phản ứng được chuẩn bị bằng cách trộn 2 µl CH3COONa 3 M với 2 µl EDTA 100 mM và 1 µl glycogen 20 mg/ml. Sản phẩm PCR được bổ sung 5 µl dung dịch làm ngừng phản ứng trên. Hỗn hợp được trộn đều, sau đó được tiếp tục cho thêm 60 µl ethanol 95% lạnh và được ly tâm 14.000 vòng/phút ở 4oC trong 15 phút. Phần dịch nổi được loại bỏ nhẹ nhàng. Kết tủa được rửa lại bằng cách bổ sung 200 µl ethanol 70% lạnh và ly tâm 14.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Kết tủa được hòa tan trở lại trong 40 µl dung dịch đệm tra mẫu. Mẫu sau khi xử lý được đưa vào máy CEQ8000 để đọc trình tự nucleotide bằng phương pháp điện di mao quản.