B: Trình tự axit amin.
3.1.5. Kết quả thiết kế đoạn gen ltb-gp
Theo thiết kế ban đầu, trong trình tự đoạn gen gp5m có hai vị trí cắt của enzyme giới hạn NcoI nằm giữa 2 đầu gen m. Do đó, đoạn gen ltb-gp5 sẽ đƣợc tạo ra bằng cách cắt vector pBT-gp5m với enzyme giới hạn NcoI để loại bỏ gen m. Sản phẩm cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% cho kết quả nhƣ Hình 3.8.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 62
Hình 3.8: Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme giới hạn
NcoI trên gel agarose 1%. 1: vector pBT-ltb-gp5m không cắt, 2: sản phẩm cắt vector pBT-
ltb-gp5m với enzyme NcoI; M:Thang chuẩn ADN 1kb (Geneshun).
Vector pBT-ltb-gp5m có kích thƣớc khoảng 4300 bp nên khi cắt hoàn toàn với enzyme NcoI sẽ tạo ra hai băng lần lƣợt khoảng 600 bp và 3700 bp. Tuy nhiên ảnh điện di cho thấy sản phẩm cắt thu đƣợc gồm 3 băng, ngoài 2 băng có kích thƣớc đúng nhƣ dự kiến còn một băng mờ ở giữa. So sánh với kết quả điện di vector dạng chƣa cắt (giếng 1) cho thấy đây chính là phần vector pBT-ltb-gp5m chƣa bị cắt. Băng đậm ở phía trên cùng (giếng 2) chính là phần còn lại của vector pBT-ltb-gp5m
sau khi đã bị cắt bỏ gen m. Do vậy chúng tôi tiến hành tinh sạch băng ADN này từ bản gel agrose. Sau khi tinh sạch, đoạn ADN này lại đƣợc tự nối trở lại sử dụng enzyme nối T4 ADN ligase. Sản phẩm của phản ứng nối sau đó đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH 5α. Tuy nhiên sản phẩm ADN tinh sạch từ bản gel có thể bị lẫn vector pBT-ltb-gp5m chƣa bị cắt. Do đó, plasmid trong các khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch sau khi biến nạp đƣợc chúng tôi kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi M13 F/M13 R. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1% chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ Hình 3.9.
1 2 M
500 bp 4000 bp 4000 bp
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 63
Hình 3.9: Ảnh điện di sản phẩm PCR kiểm tra kết quả thiết kế vector pBT-ltb-gp5
trên gel agarose 1%. 1-5: Kí hiệu các khuẩn lạc; M: Thang chuẩn ADN 1kb (Thermo Scientific).
Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các dòng kiểm tra sản phẩm PCR đều lên băng với kích thƣớc khoảng 1000 bp đúng nhƣ tính toán. Chứng tỏ chúng tôi đã tạo thành công vector pBT-ltb-gp5 từ vector pBT-ltb-gp5m.
Nhƣ vậy, bằng các kỹ thuật sinh học phân tử nhƣ PCR, cắt ADN bằng enzyme giới hạn, tách dòng ... chúng tôi đã thiết kế thành công các đoạn gen ltb- gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3. Đồng thời dòng hóa thành công các đoạn gen này vào vector tách dòng pBT. Các vector pBT-ltb-gp5m, pBT –ltb-gp5, pBT ltb-gp3 đƣợc lƣu giữ trong chủng vi khuẩn E. coli DH5α sẵn sàng cho các thí nghiệm tiếp theo.