Luận văn thạc sĩ 201 1– 2013
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 30
Sơ đồ 2.1: Tóm tắt quy trình nghiên cứu.
PCR với cặp mồi gp5-for/cmyc-rev PCR với cặp mồi ltb-for/ltb5-rev hoặc ltb-for/ltb3-rev PCR với cặp mồi gp3-for/cmyc-rev
Đoạn gengp5m genltb5 genltb3 gengp3
Overlapping-PCR với cặp mồi ltb-for/cmyc-rev
Vector pBSK-gp5m Vector pSHELP-ltb Vector pBSK-gp3
Overlapping-PCR với cặp mồi ltb-for/cmyc-rev
Đoạn genltb-gp5m Đoạn genltb-gp3
Nối vào vector tách dòng pBT/T
Vector pBT-ltb-gp5m Vector pBT-ltb-gp3
Vector pBT-ltb-gp5
Cắt với enzyme
NcoI
Thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật Gateway qua hai phản ứng BP và LR. Phản ứng LR sử dụng vector nhận là vector pCB-GW-35S
Vector pCB-GW-35S -ltb-gp5m Vector pCB-GW-35S-ltb-gp3
Vector pCB-GW-35S-ltb-gp5
Chuyển các đoạn gen quan tâm vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sàng lọc các dòng BY-2 mang gen cần chuyển bằng kháng sinh chọn lọc và bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen.
BY-2-35S-ltb-gp5m BY-2-35S-ltb-gp3
BY-2-35S-ltb-gp5
Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã bằng RT-PCR và ở mức độ dịch mã bằng điện di kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide, lai miễn dịch Western Blot.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 31
Quá trình nghiên cứu gồm 4 bƣớc chính:
Bƣớc 1: Thiết kế các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3
- Trình tự gen ltb đƣợc nối vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3 bằng phản ứng overlapping-PCR. Sản phẩm của phản ứng nối bằng PCR đƣợc đƣa vào vector tách dòng pBT/T và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH 5α. Kết quả biến nạp đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) và phƣơng pháp cắt plasmid tái tổ hợp với enzyme giới hạn BamHI.
- Tiến hành giải trình tự để chọn ra dòng vi khuẩn chứa vector tái tổ hợp pBT mang đoạn gen ltb-gp5m hoặc ltb-gp3 có trình tự không làm thay đổi trình tự axit amin tƣơng ứng khi dịch mã phục vụ các thí nghiệm tiếp theo.
- Theo tính toán ban đầu, đoạn gen gp5m đƣợc thiết kế có chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn NcoI nằm ở hai đầu của gen m. Do vậy, để tạo ra vector pBT-
ltb-gp5 chỉ cần cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme NcoI nhằm loại bỏ gen m. Mô hình cấu trúc các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3 đƣợc minh họa trên Hình 2.1.
Hình 2.1. Mô hình thiết kế cấu trúc các đoạn gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3.
Bƣớc 2: Thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật sử dụng kỹ thuật GateWay
- Việc thiết kế vector chuyển gen vào tế bào thực vật bằng kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện qua hai phản ứng: BP và LR, sử dụng vector nhận là vector pCB- GW-35S. Cuối cùng tạo ra các vector chuyển gen pCB-GW-35S-ltb-gp5, pCB-GW- 35S-ltb-gp5m, pCB-GW-35S-ltb-gp3.
Bƣớc 3: Chuyển các đoạn gen quan tâm vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trƣởng BY-2 thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 32
- Biến nạp các vector chuyển gen đã thiết kế thành công vào tế bào vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 bằng phƣơng pháp xung điện. Kiểm tra kết quả biến nạp bằng phƣơng pháp PCR.
- Chuyển các đoạn gen quan tâm vào dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trƣởng BY-2 thông qua chủng vi khuẩn A. tumefaciens CV58 pGV2260.
- Bƣớc đầu sàng lọc các dòng tế bào BY-2 mang gen cần chuyển trên môi trƣờng đặc có bổ sung kháng sinh chọn lọc thích hợp.
- Các dòng phát triển tốt trên môi trƣờng có kháng sinh chọn lọc đƣợc kiểm tra sự có mặt của gen cần chuyển bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen.
Bƣớc 4: Kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển vào trong tế bào BY-2
- Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ phiên mã: Sử dụng phƣơng pháp RT-PCR.
- Kiểm tra sự biểu hiện của gen ở mức độ dịch mã: Sử dụng phƣơng pháp điện di kiểm tra protein tổng số trên gel polyacrylamide và phƣơng pháp lai miễn dịch Western Blot.