Luận văn thạc sĩ 201 1– 2013
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp PCR
a. PCR khuếch đại các đoạn gen gp5m, gp3, ltb từ các khuôn tương ứng
Với mục đích tăng cƣờng khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể trong việc chuyển tải kháng nguyên qua đƣờng miệng, gen mã hóa cho protein LTB (Labile Toxin B subunit - độc tố không chịu nhiệt lấy từ vi khuẩn E. coli) đƣợc nối vào mỗi gen gp5m, gp3 bằng overlapping-PCR.
Để phục vụ cho phản ứng nối, trƣớc tiên các gen gp5m, gp3, ltb đƣợc khuếch đại từ các khuôn tƣơng ứng bằng phản ứng PCR sử dụng các cặp mồi đã
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 33
đƣợc thiết kế đặc thù. Thành phần phản ứng và điều kiện chu trình nhiệt đƣợc mô tả trong Bảng 2.2 và Bảng 2.3.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại các gen gp5m, gp3, ltb từ các khuôn tƣơng ứng
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
H2O
Đệm Pfu ADN polymerase 10 X MgSO4 25 mM
dNTPs 2 mM mỗi loại Mồi xuôi 10 pM Mồi ngƣợc 10 pM
Pfu ADN polymerase (5 U/µl) ADN khuôn 16.3 2.5 2.0 1.0 1.0 1.0 0.2 1.0 Tổng thể tích 25
Bảng 2.3: Mồi, ADN khuôn và chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại các gen gp5m, gp3, ltb
Gen cần khuếch đại Mồi ADN khuôn Chu trình nhiệt
gp5m
gp5-for
Vector pBSK-gp5m - Biến tính lần đầu : 94
o C trong 5 phút - Lặp lại 28 chu kỳ : + Biến tính : 94oC trong 30 giây + Gắn mồi : 52oC trong 30 giây + Tổng hợp : 72o C trong 90 giây - Tổng hợp bƣớc cuối : 72oC trong 10 phút. cmyc-rev ltb5 ltb-for Vector pSHELP-ltb ltb5-rev gp3 gp3-for Vector pBSK-gp3 cmyc-rev ltb3 ltb-for Vector pSHELP-ltb ltb3-rev
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 34
b. Overlapping-PCR nối gen ltb vào đầu 5’ của các gen gp5m, gp3
Sản phẩm PCR khuếch đại các gen phía trên đƣợc sử dụng trực tiếp làm khuôn cho phản ứng overlapping-PCR nhằm nối gen ltb vào đầu 5’ của các gen
gp5m, gp3. Phản ứng đƣợc tiến hành với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.4 và Bảng 2.5.
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng overlapping-PCR nối gen ltb vào các gen gp5m,
gp3
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
H2O
Đệm Pfu ADN polymerase 10 X MgSO4 25 mM
dNTPs 2 mM mỗi loại Mồi ltb-for 10 pM Mồi cmyc-rev 10 pM
Pfu ADN polymerase (5 U/µl) ADN khuôn 32.5 5.0 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4 2.0 Tổng thể tích 50
Bảng 2.5: Mồi, ADN khuôn và chu trình nhiệt sử dụng cho phản ứng overlapping- PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3
Mục đích ADN khuôn Chu trình nhiệt
Nối gen ltb vào gen gp5m - Sản phẩm PCR khuếch đại gen gp5m - Sản phẩm PCR khuếch đại gen ltb5
- Biến tính lần đầu : 94oC trong 5 phút - Lặp lại 28 chu kỳ :
+ Biến tính : 94oC trong 30 giây + Gắn mồi : 52oC trong 30 giây + Tổng hợp : 72oC trong 1 phút 40 giây - Tổng hợp bƣớc cuối : 72oC trong 10 phút có bổ sung 1 U Dream Taq ADN polymerase. Nối gen ltb vào gen gp3 - Sản phẩm PCR khuếch đại gen gp3 - Sản phẩm PCR khuếch đại gen ltb3
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 35
- Không bổ sung mồi ở 5 chu kì đầu tiên.
2.2.2.2.Phương pháp tinh sạch ADN từ gel agarose
Sản phẩm PCR hoặc sản phẩm cắt ADN với enzyme giới hạn đƣợc tinh sạch từ gel (thôi gel) sử dụng bộ Kit “GeneJET Gel Extraction Kit” (Thermo Scientific) theo các bƣớc nhƣ sau [50] :
(1) Điện di hỗn hợp ADN trên gel agarose 1%, sử dụng máy soi gel cắt lấy băng ADN quan tâm từ bản gel bỏ vào các ống eppendorf 2 ml vô trùng. Xác định khối lƣợng của mỗi miếng gel;
(2) Bổ sung dung dịch Binding theo tỷ lệ: Vmẫu : Vdd = 1 : 1 (100 l dung dịch tƣơng ứng với 100 mg mẫu). Ủ ở 600C đến khi miếng gel tan hoàn toàn; (3) Chuyển hỗn hợp lên cột thôi gel, ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút,
trong 1 phút;
(4) Loại bỏ dịch chảy qua cột; (5) Bổ sung 700 l dung dịch rửa;
(6) Ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút; (7) Loại bỏ dịch chảy qua cột;
(8) Lặp lại bƣớc (6), (7);
(9) Chuyển cột sang ống eppendorf vô trùng 1,5 ml; (10) Để khô cột ở nhiệt độ phòng trong 5 phút;
(11) Bổ sung 25 – 30 µl nƣớc deion khử trùng vào chính giữa cột, giữ cột ở nhiệt độ phòng 2 phút, sau đó ly tâm ở điều kiện 13.000 vòng/phút trong 1 phút. Thu lấy dịch chảy qua cột.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 36
Sản phẩm của phản ứng overlapping-PCR nối gen ltb vào các gen gp5m, gp3
sau khi tinh sạch đƣợc đƣa vào vector pBT/T bằng phản ứng nối nhờ enzyme T4 ADN ligase với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần và điều kiện phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT/T sử dụng enzyme T4 ADN ligase
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
H2O
Đệm T4 ADN ligase 10 X Enzyme T4 ADN ligase (5 U/µl) Vector pBT/T (100 ng/µl) Sản phẩm PCR đã tinh sạch 2.0 1.0 1.0 1.0 5.0 Tổng thể tích 10 Ủ hỗn hợp ở 220C trong 2 giờ
2.2.2.4. Phương pháp biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH 5α
Để biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH 5α chúng tôi sử dụng phƣơng pháp sốc nhiê ̣t . Đây là phƣơng pháp đơn giản , phổ biến và tiê ̣n lợi để đƣa plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn . Quá trình biến nạp đƣợc thực hiện theo theo Sambrook và Russell [46] với các bƣớc nhƣ sau:
(1)Tế bào E. coli khả biến đƣợc lấy từ tủ -80oC, để tan trên đá trong 5 phút; (2)Bổ sung 10 µl sản phẩm nối, búng nhẹ, ủ trên đá 30 phút;
(3)Sốc nhiê ̣t hỗn hợp ở 42oC trong 60 giây; (4)Đặt lại hỗn hợp trên đá 3 phút;
(5)Bổ sung 1 ml môi trƣờng LB lỏng, chuyển hỗn hợp sang ống penicillin, ủ ở 37o
C trong 20 phút sau đó lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 30 phút; (6)Trải 200 µl dịch khuẩn lên đĩa tha ̣ch có bổ sung chất chọn lọc thích hợp.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 37
Quy trình tách plasmid bằng phƣơng pháp biến tính kiềm đƣợc tiến hành theo Sambrook và Russell [46] với các bƣớc nhƣ sau:
(1)Ly tâm 1,5 ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm ở 10,000 vòng/phút trong 5 phút; bỏ dịch trong, thu lấy cặn tế bào;
(2)Hòa cặn trong 100 µl dung dịch I (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA pH 8), vortex, ủ ở nhiệt độ phòng 10 phút;
(3)Thêm 200 µl dung dịch II (0.2 N NaOH, 1% SDS), đảo nhẹ, ủ trên đá 3 phút; (4)Thêm 150 µl dung dịch III (3 M KOAc pH 5.2), ủ trên đá 5 phút;
(5)Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch trong; (6)Bổ sung 1 thể tích Phenol:Chloroform:Isoamyl (25:24:1), đảo nhẹ;
(7)Ly tâm hỗn hơ ̣p ở nhiệt độ phòng , 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu dich pha trên;
(8)Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol 100%, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút;
(9)Ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu lấy tủa ADN;
(10) Rửa tủa bằng 0,5 ml cồn 70% lạnh rồi ly tâm 13000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ dịch trong;
(11) Để tủa khô, hòa tan tủa trong 20 - 30 µl nƣớc hoặc TE có bổ sung RNase A đến nồng độ cuối cùng là 20 µg/ml.
2.2.2.6. Phương pháp kiểm tra kết quả biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn
Các khuẩn lạc m ọc trên đĩa tha ̣ch có b ổ sung kháng sinh chọn lọc bƣớc đầu đƣợc kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp mang đoạn gen quan tâm bằng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR). Đây là phƣơng pháp nhanh, đơn giản bởi sử dụng trực tiếp các tế bào vi khuẩn làm khuôn cho phản ứng PCR. Tuy nhiên, để có kết quả chính xác hơn, các khuẩn lạc dƣơng tính từ phản ứng colony-PCR đƣợc nuôi lỏng qua đêm rồi tiến hành tách thu lấy plasmid. Sau đó tiến hành cắt các plasmid này với enzyme giới hạn thích hợp hoặc sử dụng chính
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 38
plasmid làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen, vector hoặc giữa gen và vector.
Trong nghiên cứu này, để kiểm tra kết quả nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng pBT/T, bƣớc đầu chúng tôi sử dụng phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc, sau đó các dòng cho kết quả PCR dƣơng tính đƣợc nuôi lỏng qua đêm để tách thu lấy plasmid và cắt các plasmid này với enzyme giới hạn BamHI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt đƣợc mô tả trong Bảng 2.7
Bảng 2.7: Thành phần phản ứng cắt plasmid với enzyme giới hạn BamHI.
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
H2O
Đệm enzyme BamHI 10 X Enzyme BamHI (10 U/µl) Plasmid tái tổ hợp 10.2 1.5 0.3 3.0 Tổng thể tích 15 Ủ hỗn hợp ở 370C trong 2 giờ
2.2.2.7. Phương pháp thiết kế đoạn gen ltb-gp5
Theo tính toán ban đầu, đoạn gen gp5m đƣợc thiết kế có chứa hai vị trí cắt của enzyme giới hạn NcoI nằm ở hai đầu của gen m, do vậy để tạo ra đoạn gen nối
ltb-gp5 chỉ cần cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme NcoI. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt đƣợc minh họa trong Bảng 2.8.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 39
Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt vector pBT-ltb-gp5m với enzyme giới hạn
NcoI
Thành phần phản ứng Thể tích (µl)
H2O
Đệm enzyme NcoI 10 X Enzyme NcoI (10 U/µl) Vector pBT-ltb-gp5m 23.5 3.0 0.5 3.0 Tổng thể tích 30 Ủ hỗn hợp ở 370C trong 2 giờ
2.2.2.8. Phương pháp thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật GateWay
Để tiến hành thiết kế vector chuyển gen bằng kỹ thuật Gateway, trƣớc tiên các đoạn gen cần chuyển (ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3) đƣợc gắn các trình tự attB1, attB2 tƣơng ứng vào hai đầu 5’, 3’ của gen bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi attB1-ltb/attB2-cmyc (ngoài vùng trình tự đặc hiệu cho gen, các mồi này còn đƣợc gắn thêm trình tự attB1 hoặc attB2 ở đầu 5’). Thành phần và điều kiện cho phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.9.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 40
Bảng 2.9: Thành phần và điều kiện chu trình nhiệt cho phản ứng PCR gắn các vị trí attB1, attB2 vào hai đầu của các gen ltb-gp5m, ltb-gp5, ltb-gp3
Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Chu trình nhiệt
H2O
Đệm Pfu ADN polymerase 10 X MgSO4 25 mM
dNTPs 2 mM mỗi loại Mồi attB1-ltb 10 pM Mồi attB2-cmyc 10 pM
Pfu ADN polymerase (5 U/µl) ADN khuôn (plasmid pBT mang đoạn gen tƣơng ứng)
32.6 5.0 4.0 2.0 2.0 2.0 0.4 2.0 - Biến tính lần đầu: 94oC trong 5 phút - Lặp lại 28 chu kỳ : + Biến tính: 94oC trong 30 giây + Gắn mồi: 58o C trong 30 giây + Tổng hợp: 72o C trong 1 phút 40 giây - Tổng hợp bƣớc cuối: 72oC trong 5 phút. Tổng thể tích 50
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc sử dụng cho phản ứng BP với các thành phần và điều kiện nhƣ Bảng 2.10. Bảng 2.10: Thành phần và điều kiện phản ứng BP Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nƣớc 4.0 BP clonase mix 5X 2.0 Vector pDONR 201 ( 100 ng/µl) 2.0 attB1-ltb-gp5m-attB2 (100 ng/µl) 2.0 (hoặc attB1-ltb-gp5-attB2 hoặc attB1-ltb-gp3-attB2)
Tổng thể tích 10
Hỗn hơ ̣p đƣợc ủ ở 25o
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 41
Tiếp theo, các vector pDONR 201-ltb-gp5m, pDONR 201-ltb-gp5, pDONR 201-ltb-gp3 thu đƣợc từ phản ứng BP đƣợc lai với vector pCB-GW-35S qua phản ứng LR. Thành phần và điều kiện phản ứng LR đƣợc minh họa trong Bảng 2.11.
Bảng 2.11: Thành phần và điều kiện phản ứng LR Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nƣớc 4.0 LR clonase mix 5X X 2.0 Vector pCB-GW-35S (100 ng/µl) 2.0 Vector pDONR 201-ltb-gp5m (100 ng/µl) 2.0
(hoặc Vector pDONR 201-ltb-gp5 hoặc Vector pDONR 201-ltb-gp3)
Tổng thể tích 10
Hỗn hơ ̣p đƣợc ủ ở 25o
C trong 10 giờ
2.2.2.9. Phương phá p xác đi ̣nh nồng độ axit nucleic [15]
Nồng độ axit nucleic đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đo quang phổ.
Cấu trúc vòng thơm của các ribonucleotide (hay nucleotide ) cấu tạo nên ADN (hay ARN) tạo cho chún g có cƣờng đô ̣ hấp thu ̣ tia tƣ̉ ngoa ̣i (UV) cƣ̣c đa ̣i ở bƣớc sóng 260 nm. Khi tia UV đƣợc chiếu qua dung di ̣ch axit nucleic , mƣ́c hấp thu ̣ tia UV phu ̣ thuô ̣c vào nồng đô ̣ của các axit nucleic . Đây chính là nguyên lý cơ bản của việc dùng máy quang phổ để xác định nồng độ axit nucleic .
Nồng độ axit nucleic đƣợc tính theo công thức: C (µg/ml) = A260×n×k Trong đó:
C: Nồng độ axit nucleic;
A260: Độ hấp thụ của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm; n: Số lần pha loãng mẫu;
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 42
k: Nồng độ axit nucleic (µg/ml) ứng với A260 là 1. (ADN: k=50, ARN: k=40, oligonucleotide: k=25)
Khác với ADN và ARN, protein hấp thu ̣ tia tƣ̉ ngoa ̣i cƣ̣c đa ̣i ở bƣớc sóng 280 nm (chủ yếu do cấu trúc vòng thơm của axit amin tryptophan tạo nên ). Do vậy, nồng độ và độ tinh sạch của mẫu axit nucleic có thể đƣ ợc xác định bằng cách đo độ hấp thụ của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm (A260) và 280 nm (A280). Đối với ADN, mẫu đƣợc xem là tinh sạch khi tỉ lệ A260 /A280 nằm trong khoảng 1,8 đến 2,0. Nếu có protein, chỉ số này t hƣờ ng thấp hơn 1,8. Nếu tỷ số này lớn hơn 2 thì chế phẩm có thể lẫn nhiều ARN [15].
Ngoài ra nồng độ ADN còn đƣợc đánh giá ƣớc lƣợng qua phƣơng pháp điện di với thang chuẩn . Trong thang chuẩn , các băng đã đƣợc biết nồng độ do vậy khi điê ̣n di mẫu với thang chuẩn trên cùng mô ̣t bản gel có thể ƣớc lƣợng nồng đô ̣ của mẫu nghiên cƣ́u.
2.2.2.10. Phương pháp điện di axit nucleic trên gel agarose
Điện di là hiện tƣợng di chuyển của các phần tử mang điện tích trong một giá thể dƣới tác dụng của dòng điện một chiều [15].
Phân tử axít nucleic tích điện âm do chứa gốc phosphate nên ở pH trung tính hoặc kiềm chúng sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dƣơng với tốc độ di chuyển phụ thuộc vào kích thƣớc hoặc trạng thái của phân tử. Đây là cơ sở để phân tách các đoạn ADN/ARN có kích thƣớc, hình dạng khác nhau [14, 15].
Trong nghiên cứu này, phƣơng pháp điện di axit nucleic trên gel agarose đƣợc thực hiện trong đệm TAE 1X [44] (45 mM Tris borate, 20 mM Acetic acid, 1 mM EDTA). Phƣơng pháp nhuộm ethidium bromide đƣợc sử dụng nhằm phát hiện các phân tử ADN/ARN trên bản gel.
2.2.2.11. Biến nạp vector chuyển gen vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 bằng phương pháp xung điện
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 43
Quy trình biến nạp vector chuyển gen vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens
CV58 pGV2260 bằng phƣơng pháp xung điện đƣợc thực hiện với các bƣớc nhƣ sau [10, 43]:
(1) Lấy tế bào khả biến từ tủ -800C, đặt trên đá 5 phút cho tan; (2) Bổ sung 1-2 µl plasmid vào hỗn hợp tế bào khả biến, búng nhẹ; (3) Chuyển tất cả dịch trên vào cuvette xung điện;
(4) Xung điện ở điều kiện 2,5 kV, 25 µF, 400 Ω. Đặt ngay cuvette vào đá, ủ 5 phút;
(5) Bổ sung 500 l LB lỏng và trộn nhẹ. Chuyển hỗn hợp sang ống penicillin;
(6) Hỗn hợp đƣợc lắc ở 200 vòng/phút, 28oC trong 1h;
(7) Trải 100 l dịch khuẩn lên môi trƣờng LB đặc có chứa kháng sinh kanamycin (50 µg/ml), rifamycin (25 µg/ml). Ủ đĩa khuẩn ở 28o
C trong 48 giờ.
2.2.2.12. Phương pháp chuyển gen vào tế bào thuốc lá siêu sinh trưởng BY-2 sử dụng tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 [10]
a. Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào BY-2 và vi khuẩn A. tumefaciensCV58 pGV2260 mang các vector chuyển gen
Chuẩn bị dịch huyền phù tế bào thuốc lá BY-2
Năm ngày trƣớc khi biến nạp, bắt đầu cấy chuyển: chuyển 1 ml tế bào BY-2 sang 50 ml môi trƣờng mới, nuôi lắc trong tủ tối (tốc độ 120 vòng/phút) ở 28˚C.
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A. tumefaciens CV58 pGV2260 mang các vector chuyển gen
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 44
- Lấy chủng Agrobacterium gốc và cấy vạch lên môi trƣờng LB đặc có bổ