Luận văn thạc sĩ 201 1– 2013
2.1.1. Nguyên vật liệu
a. Các vector
- Vector pBluescript II KS+ mang đoạn gen gp5m đã đƣợc tối ƣu hóa mã phù hợp với sự biểu hiện trong tế bào thực vật. Kí hiệu: pBSK-gp5m.
- Vector pBluescript II KS+ mang gen gp3 đã đƣợc tối ƣu hóa mã phù hợp với sự biểu hiện trong tế bào thực vật. Kí hiệu: pBSK-gp3.
- Vector pSHELP mang gen ltb (Lê Văn Sơn và cộng sự, 2008). Kí hiệu: pSHELP-ltb.
- Vector tách dòng pBT/T (Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam).
- Vector pDONR 201 nằm trong bộ kít Gateway (Invitrogen).
- Vector chuyển gen thực vật pCB-GW-35S (Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học).
b. Chủng vi sinh vật
- Dòng tế bào vi khuẩn E. coli DH 5α dùng cho biến nạp vector tái tổ hợp. - Dòng tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens CV58 pGV2260 sử dụng cho việc chuyển các gen quan tâm vào tế bào thuốc lá siêu sinh trƣởng BY-2.
c. Dòng tế vào thực vật
- Dòng tế bào thuốc lá siêu sinh trƣởng BY-2 đƣợc lƣu giữ tại phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học.
d. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR
Danh sách mồi sử dụng cho các phản ứng PCR trong toàn bộ nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng 2.1.
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 27
Bảng 2.1: Danh sách mồi sử dụng cho PCR trong toàn bộ nghiên cứu
STT Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) 1 gp5-for CATGGAGAACCCCGGGATGCTTGGGAAATG 2 cmyc-rev GCCTCGAGTCAATTAAGGTCTTCTTCAG 3 ltb-for GCTTAATTAAATGGCTCCACAATCCATCACTG 4 ltb5-rev TCCCAAGCATCCCGGGGTTCTCCATGCTGA 5 ltb3-rev AATTTGCCATCCCGGGGTTCTCCATGCTGA 6 gp3-for CATGGAGAACCCCGGGATGGCAAATTCTTG 7 attB1-ltb GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCTC CACAATCCATCACTG 8 attB2-cmyc GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAATTA AGGTCTTCTTCAG 9 M13 Forward GTAAAACGACGGCCAG 10 M13 Reverse CAGGAAACAGCTATGAC 11 P35S-for ACAAACAACATTACAATTTACTATTCTAGTCG 2.1.2. Hóa chất
- Các hóa chất dùng cho PCR : Taq ADN polymerase (Thermo Scientific), đệm Taq ADN polymerase 10 X, Pfu ADN polymerase (Thermo Scientific), đệm
Pfu ADN polymerase 10 X, MgSO4 25 mM, dNTPs 2 mM mỗi loại (Thermo Scientific) ….
- Các enzyme: enzyme giớ i ha ̣n NcoI, BamHI (Thermo Scientific, New England BioLabs) và đệm tƣơng ứng, enzyme nối T4 ADN ligase (Thermo Scientific) và đệm tƣơng ứng, enzyme RNase A ….
- Bộ kít tinh sạch sản phẩm PCR “GeneJET PCR Purification Kit” (Thermo Scientific).
- Bộ kít tinh sạch ADN từ gel “GeneJET Gel Extraction Kit” (Thermo Scientific).
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 28
- Bộ kít GateWay (Invitrogen).
- Bộ kít tách ARN tổng số “GeneJET™ RNA Purification Kit” (Thermo Sciencetific).
- Bộ kít tổng hợp cDNA “RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit” (Thermo Sciencetific).
- Môi trƣờ ng nuôi cấy vi khuẩn : môi trƣờng Lubertani broth (LB) với các thành phần theo Sambrook và Russell [46].
- Môi trƣờng nuôi cấy tế bào BY-2 với các thành phần theo Nagato và cộng sự, 1992 [57].
- Các hóa chất sử dụng cho tách plasmid bằng phƣơng pháp biến tính kiềm [46]: dung dịch I (50 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM glucose, 10 mM EDTA pH 8), dung dịch II (0.2 N NaOH, 1% SDS), dung dịch III (3 M KOAc pH 5.2), Phenol:Chloroform:Isoamyl (25:24:1), isopropanol 100% (Merk), ethanol 100 % (Merk) ....
- Các hóa chất sử dụng cho tách ADN tổng số từ tế bào thực vật: CTAB (Invitrogen), NaCl (Sigma), Tris base (Sigma), EDTA (Sigma) ....
- Các hóa chất dùng cho điện di axit nucleic: Đệm TAE với các thành phần theo Sambrook và Russell [44] (40 mM Tris acetate, 1 mM EDTA , pH 8.2 - 8.4); đệm loading mẫu 6 X, các loại thang chuẩn ADN (Thermo Scientific, Eurogentec, Geneshun) ….
- Acetosyringone (100 mM); các kháng sinh: ampicillin (50 mg/ml), kanamycin (50 mg/ml), cefotaxim (500 mg/ml), rifamicin (25 mg/ml).
- Các hóa chất sử dụng cho phân tích protein [16, 35, 45]: dung dịch PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Sodium Phosphate dibasic, 2 mM Potassium Phosphate monobasic, pH 7.4), đệm điện di protein (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS), Comasie brilient blue 250, dung dịch TBS (20 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5), dung dịch chuyển màng (25 mM Tris, 192 mM glycine, 20%
Luận văn thạc sĩ 2011 – 2013 29
methanol, 0.1% SDS), dung dịch cố định màng (0.1% Tween 20, 3% BSA trong TBS), Methanol 100%, Tween 20, BSA, ....
- Các hóa chất khác đều có độ tinh khiết cao , đạt yêu c ầu dùng cho nghiên cƣ́u.
2.1.3. Thiết bị
Các máy móc, thiết bị phục vụ cho nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam: Máy PCR, bộ điện di ADN, bộ điện di protein, máy soi gel, bể ổn nhiệt, máy lắc ổn nhiệt, máy ly tâm, tủ cấy vô trùng ….