II. Phương
2. Thí nghiệm 1: Phân tích thành phần nguyên liệu
Mục đích: phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu làm cơ sởđể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Chỉ tiêu phân tích:
• Nitơ tổng: phương pháp Kejndan • pH: sử dụng máy đo pH
• Hàm lượng chất khô hòa tan: dùng Brix kế. Phân tích thành phần nguyên liệu. (TN.1) Thêm đường, điều chỉnh độ Brix.
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 18 Công nghệ Sinh học K31
3. Thí nghiệm 2: Phân lập nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên
Mục đích: phân lập được những dòng nấm men tự nhiên thuần chủng từ dịch xoài lên men tự nhiên để tiến hành nghiên cứu lên men rượu xoài và làm
nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Tiến hành:
• Xoài chín bỏ vỏ và hột, xay nhuyễn, cân. • Ướp đường với tỉ lệ (xoài:đường) 3:1
• Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (280-340C) trong khoảng 24h. • Tiến hành phân lập nấm men trên môi trường PGA, ủở 300C
• Chọn những khuẩn lạc rời rạc để cấy chuyển theo cách phân lập đến khi chọn
được dòng thuần.
• Trữ giống trong môi trường PGA (ống nghiệm) để tiến hành cho các thí nghiệm
tiếp theo.
4. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng lên men dịch xoài của các dòng nấm menvừa phân lập được và nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng chai Durham vừa phân lập được và nấm men Saccharomyces cerevisiae bằng chai Durham
Mục đích: Chọn ra dòng nấm men có khả năng lên men dịch xoài tốt nhất để tiến hành thực hiện thí nghiệm tiếp theo.
Tiến hành:
• Chai Durham gồm chai thủy tinh có nắp đậy và một ống thủy tinh nhỏ úp ngược
bên trong dùng để khảo sát sự lên men của các dòng nấm men. Mỗi dòng nấm men lặp lại 3 lần.
• Môi trường PG: là môi trường lỏng dùng để nhân giống nấm men. Thành phần giống môi trường PGA nhưng không thêm agar.
• Nấm men mới phân lập và nấm men Saccharomyces cerevisiae được nuôi trong
môi trường PG ở 300C trên máy lắc (150 vòng/phút) trong 24h.
• Cho 9ml dịch quả xoài chỉnh độ Brix 2% vào mỗi chai Durham, sau đó đem khử trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội.
• Cho thêm 3ml dung dịch nấm men vào chai Durham có dịch nước xoài, ủở nhiệt độ phòng.
Chỉ tiêu theo dõi:
• Đo chiều cao trung bình cột khí CO2 trong các ống ở các thời điểm 12h, 18h, 30h, 54h, 60h…. Dòng nấm men nào có cột khí CO2 cao nhất ở cùng thời điểm lên men thì biểu hiện sự lên men mạnh nhất.
• Chọn ra dòng nấm men cho khả năng lên men dịch xoài tốt nhất.
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 19 Công nghệ Sinh học K31
5. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ nguyên liệu đến khả năng lên mencủa các dòng nấm men của các dòng nấm men
Mục đích: Chọn ra dòng nấm men và độ pha loãng nguyên liệu để nấm men lên men dịch xoài tốt nhất.
Chuẩn bị: Nuôi 5 dòng nấm men trong môi trường PG trên máy lắc (150 vòng/phút, 300C) trong 24h.
Bố trí thí nghiệm: tiến hành lên men trong bình tam giác, mỗi bình 150ml dịch lên men với 2 nhân tố, lặp lại 2 lần.
• Nhân tố dòng nấm men (5 dòng): Y09006, Y09007, Y09008, Y09009 và dòng nấm men thị trường.
• Nhân tốđộ pha loãng nguyên liệu (3 mức độ): 20%, 35% và 50%. Tiến hành:
• Xoài chín bóc vỏ bỏ hột, xay nhuyễn và pha loãng ở các nồng độ 20%, 35% và 50%.
• Điều chỉnh dịch xoài đến 250 Brix bằng đường tinh luyện.
• Cho 150ml dịch xoài vào mỗi bình tam giác và chủng 15ml dịch nấm men đã được nuôi vào như bố trí thí nghiệm.
Bảng 5: Bố trí thí nghiệm của thí nghiệm 4
Nghiệm thức Nấm men % NL Nghiệm thức Nấm men % NL 1 Y09006 20 9 Y09008 50 2 Y09006 35 10 Y09009 20
3 Y09006 50 11 Y09009 35 4 Y09007 20 12 Y09009 50 5 Y09007 35 13 TT 20 6 Y09007 50 14 TT 35 7 Y09008 20 15 TT 50 8 Y09008 35
Các chỉ tiêu theo dõi:
• Nồng độ chất khô hòa tan sau khi lên men: được đo bằng Brix kế • pH: đo trước khi lên men và sau khi thành phẩm bằng pH kế.
• Nồng độ rượu: rượu sau khi lên men tiến hành chưng cất sau đó đo nồng độ rượu bằng rượu kế.
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 20 Công nghệ Sinh học K31
6. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố: nồng độ men giống, độBrix ban đầu và độ pha loãng nguyên liệu lên quá trình lên men rượu xoài Brix ban đầu và độ pha loãng nguyên liệu lên quá trình lên men rượu xoài
Mục đích: xác định được các mức độ thích hợp nhất của các nhân tốđộ Brix ban đầu, nồng độ nấm men và độ pha loãng nguyên liệu để tiến hành thí
nghiệm tiếp theo. Chuẩn bị:
• Xoài chín, bóc vỏ bỏ hột.
• Nấm men giống: nấm men chọn được ở thí nghiệm 3,4 (nấm men khô thị trường
Saccharomyces cerevisiae)
Bố trí thí nghiệm: tiến hành lên men trong bình tam giác, mỗi bình 200ml dịch lên men với 3 nhân tố, mỗi nhân tố 3 mức độ:
• Nhân tố A: nồng độđường
A1: 200 Brix A2: 250 Brix A3: 300 Brix • Nhân tố B: Nồng độ nấm men khô B1: 0,1% B2: 0,3% B3:0,5%
• Nhân tố C: độ pha loãng nguyên liệu (%) C1: 200C C2: 350C C3: 500C
Bảng 6: Bố trí thí nghiệm của thí nghiệm 5
Nghiệm thức Độ Brix Nấm men(%) % NL Nghiệm thức Độ Brix
Nấm men(%) % NL 1 20 0,1 20 15 25 0,3 50 2 20 0,1 35 16 25 0,5 20 3 20 0,1 50 17 25 0,5 35 4 20 0,3 20 18 25 0,5 50 5 20 0,3 35 19 30 0,1 20 6 20 0,3 50 20 30 0,1 35 7 20 0,5 20 21 30 0,1 50 8 20 0,5 35 22 30 0,3 20 9 20 0,5 50 23 30 0,3 35 10 25 0,1 20 24 30 0,3 50 11 25 0,1 35 25 30 0,5 20 12 25 0,1 50 26 30 0,5 35 13 25 0,3 20 27 30 0,5 50 14 25 0,3 35 Tiến hành:
• Xoài chín bóc vỏ bỏ hột, xay nhuyễn và pha loãng ở các nồng độ 20%, 35% và 50%.
• Điều chỉnh dịch xoài đến các độ Brix 20, 25 và 30.
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 21 Công nghệ Sinh học K31
• Cho 200ml dịch xoài vào mỗi bình tam giác và chủng nấm men với các nồng độ 0,1%, 0,35% và 0,5% như bố trí thí nghiệm.
• Lên men 7-8 ngày ở nhiệt độ phòng (28-340C). • Lọc và phân tích các chỉ tiêu.
Các chỉ tiêu theo dõi:
• Nồng độ chất khô hòa tan sau khi lên men: được đo bằng Brix kế • pH: đo trước khi lên men và sau khi thành phẩm bằng pH kế.
• Nồng độ rượu: rượu sau khi lên men tiến hành chưng cất sau đó đo nồng độ rượu bằng rượu kế.
7. Thí nghiệm 6: khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố pH ban đầu, nhiệt độ và xử lý nhiệt đến quá trình lên men rượu
Mục đích: chọn được nghiệm thức thích hợp nhất để lên men rượu xoài, đề xuất được quy trình sản xuất rượu vang xoài.
Bố trí thí nghiệm: tiến hành lên men trong bình tam giác, mỗi bình 250ml dịch lên men với 3 nhân tố và lặp lại 2 lần.
• Nhân tố D: Nhiệt độ lên men
D1: 250 C D2: Nhiệt độ phòng (28- 340 C) • Nhân tố E: pH ban đầu
E1: pH=4 E2: pH=4,5 E3: pH=5
F1: xử lý F2: không xử lý
Bảng 7: Bố trí thí nghiệm của thí nghiệm 6
Nghiệm thức T0 lên men pH ban đầu Xử lý NL Nghiệm thức T0 lên men pH ban đầu Xử lý NL 1 25 4 Có 7 Phòng 4 Có 2 25 4 Không 8 Phòng 4 Không 3 25 4,5 Có 9 Phòng 4,5 Có 4 25 4,5 Không 10 Phòng 4,5 Không 5 25 5 Có 11 Phòng 5 Có 6 25 5 Không 12 Phòng 5 Không Tiến hành:
• Xoài chín bóc vỏ bỏ hột, xay nhuyễn và pha loãng ở nồng độđã chọn được ở thí nghiệm 5.
• Điều chỉnh dịch xoài đến độ Brix đã được chọn ở thí nghiệm 5 (250Brix).
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 22 Công nghệ Sinh học K31
• Cho 250ml dịch xoài vào mỗi bình tam giác, đo và chỉnh pH (bằng acid citric hoặc Na2CO3) về các mức độ 4; 4,5 và 5 như bố trí thí nghiệm. • Đem những bình tam giác có nghiệm thức xử lý nguyên liệu đi đun cách thủy ở 700C trong 10 phút.
• Để nguội và chủng nấm men với nồng độđã được chọn ở thí nghiệm 5 (0,1% nấm men khô thị trường).
• Đem lên ở các nhiệt độ 250C và nhiệt độ phòng như bố trí thí nghiệm trong thời gian 7-8 ngày.
• Lọc và phân tích các chỉ tiêu. Các chỉ tiêu theo dõi:
• Nồng độ chất khô hòa tan sau khi lên men: được đo bằng Brix kế • Acid tổng số: chuẩn độ bằng NaOH 0,1N
• Nồng độ rượu: rượu sau khi lên men tiến hành chưng cất sau đó đo nồng độ rượu bằng rượu kế.
• Chọn 1 số mẫu tốt tiến hành đánh giá cảm quan rượu xoài.
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 23 Công nghệ Sinh học K31
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
------
I. Kết quả phân tích thành phần nguyên liệu xoài
Thành phần của nguyên liệu như glucid, acid, nước, nitơ,… ảnh hưởng đến quá trình lên men. Chính vì vậy, việc phân tích thành phần nguyên liệu là rất cần thiết
trước khi tiến hành lên men rượu xoài đểđảm bảo tính ổn định giữa các thí nghiệm.
Tiến hành lựa chọn nguyên liệu xoài, lấy phần thịt xử lý và đem đi phân tích.
Bảng 8: Kết quả phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu xoài
Chỉ tiêu Xoài cát Hòa lộc Xoài cát chu
pH 4.5-4.6 4.4-4.5 0Brix 20 17.67 Độẩm (%) 78.8 79.6 Acid tổng (%) 0.39 0.64 Nitơ tổng (g/kg) 0,008 0,005 Protein tổng (%) 0,5 0,3
Qua kết quả phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu xoài ta thấy nguyên liệu xoài có độẩm từ 78,8-79,6% (lược khảo tài liệu từ 78,9-82,8%), Protein tổng từ
0,3-0,5% (lược khảo tài liệu từ 0,36-0,4%), nồng độ chất khô hòa tan (bao gồm đường
tổng số) từ 17,67-200Brix (lược khảo tài liệu đường tổng số từ 16,12-17,18%). Như
vậy, kết quả phân tích thành phần hóa học của nguyên liệu xoài là khá phù hợp với
phần lược khảo tài liệu có trong bảng “Thành phần hóa học của trái Xoài” và thành
phần hóa học cũng như chất dinh dưỡng trong trái xoài chín rất thích hợp để sản xuất
rượu vang.
II. Kết quả phân lập nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên
Qua quá trình phân lập nấm men từ dịch xoài lên men tự nhiên, chúng tôi phân lập được 4 dòng nấm men. Các dòng nấm men được phân lập có đặc điểm như sau:
mặt sần, bìa răng cưa, lài. Tế bào nấm men to, hình trứng. (hình 29)
Dòng nấm men 2 (Y09007): khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bìa nguyên, mô cao. Tế bào nấm men hình que. (hình 30)
Dòng nấm men 3 (Y09008): khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bìa nguyên, lài. Tế bào nấm men nhỏ, hình bầu dục. (hình 31)
Dòng nấm men 4 (Y09009): khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu trắng đục, bề mặt nhẵn, bìa nguyên, mô cao. Tế bào nấm men to, hình ovan. (hình 32)
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 24 Công nghệ Sinh học K31
III. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng lên men của các dòng nấm men vừa phân phân
lập và nấm men thị trường bằng chai Durham
Bảng 9: Theo dõi cột khí durham (cm) tại từng thời điểm lên men của các dòng nấm men phân
lập và nấm men thị trường.
Thời Dòng nấm điểm lên men (giờ) men 12 18 30 54 60 72 78 102 126 150 Y09006 0.00 0.57 1.23 3.10 3.27 3.33 3.40 3.53 3.60 3.60 Y09007 0.00 0.00 0.00 0.00 0.10 0.57 0.90 2.00 2.83 3.13 Y09008 0.00 0.40 1.17 2.73 2.93 3.20 3.30 3.43 3.57 3.57 Y09009 0.00 0.50 1.13 2.87 3.07 3.30 3.40 3.57 3.73 3.80 Thị trường 2.17 3.97 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50 4.50
Căn cứ vào chiều cao cột khí Durham, chúng ta có thể dễ dàng nhận thấy ở từng thời điểm lên men thì cường độ lên men của các dòng nấm men là khác nhau.
Chiều cao cột khí tăng liên tục, đến thời điểm 30h thì dòng nấm men thị trường
có cột khí chiếm đầy ống (4.5cm), tiếp đó là 3 dòng nấm men Y090006 (1.23cm),
Y09008 (1.17cm) và Y09009 (1.13cm) có cường độ lên men tương đương nhau và
khá yếu hơn so với dòng nấm men thị trường. Cuối cùng là dòng nấm men Y09007 có
cường độ lên men rất yếu, cột khí tại các thời điểm (tính tới thời điểm 30giờ) đều bằng 0. 0 1 2 3 4 5 12 18 30 54 60 72 78 102 126 150
Thời điểm lên men (giờ) Chiều cao cột khí (cm)
Y09006 Y09007 Y09008 Y09009 Th_ trư_ng
Hình 2: Biều đồ chiều cao trung bình cột khí CO2 của các dòng nấm men sinh ra
theo thời gian.
Qua hình ta thấy: có sự khác biệt rất lớn về khả năng lên men giữa dòng nấm men thị trường và các dòng nấm men phân lập. Dòng nấm men thị trường có khả năng
lên men nhanh, mạnh và tốt nhất. Các dòng nấm men Y09006, Y09008, Y09009 có
khả năng lên men trung bình và gần như giữa chúng không có sự khác biệt về khả
năng lên men dịch xoài. Còn dòng Y09007 thì lên men rất yếu.
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
SVTH: Lê Hoàng Thông 25 Công nghệ Sinh học K31
IV. Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ nguyên liệu đến khả năng lên men của của
các dòng nấm men
1. Kết quả theo dõi số bọt khí CO2 thoát ra theo thời gian
Bảng 10: Kết quả số bọt khí thoát ra trong 2 phút tại các thời điểm lên men Thời Nấm điểm lên men (giờ)
men % NL 1 12 18 30 36 48 72 78 90 96 120 144 168 20% 1.5 0.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 2.0 1.5 2.0 1.0 Y09006 35% 2.0 1.0 1.5 1.5 0.5 1.5 1.5 1.5 1.0 1.0 1.5 0.5 0.5 50% 3.0 1.5 2.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.5 1.5 1.5 0.5 0.5 0.5 20% 0.0 0.5 0.5 0.0 0.5 0.5 0.5 0.0 0.5 1.5 1.0 0.0 0.0 Y09007 35% 0.0 0.5 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.5 0.0 0.0 0.0 0.0 0.5 50% 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 0.0 0.5 0.0 0.0 0.5 1.0 1.0 20% 0.5 0.0 1.5 0.5 0.5 0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 1.5 1.5 1.0 Y09008 35% 1.0 0.5 1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.5 1.0 1.0 0.5 0.5 0.0 50% 1.0 1.0 2.0 0.5 0.5 0.5 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.0 0.0 20% 0.0 0.5 1.0 0.5 1.0 1.5 1.0 1.5 1.5 1.5 1.0 1.0 0.0 Y09009 35% 0.0 1.0 1.5 1.0 1.5 2.0 1.5 1.5 2.0 2.0 2.0 1.5 0.0 50% 0.0 1.0 2.0 1.0 1.5 1.0 1.5 1.0 2.0 1.5 1.0 1.0 0.0 20% 2.5 3.5 4.5 4.5 6.0 7.0 8.0 9.5 5.5 4.5 3.0 2.5 0.5 35% 2.0 5.0 5.0 5.5 7.0 7.5 8.5 9.0 5.5 6.0 4.5 1.5 1.0 Thị trường 50% 3.0 3.0 5.0 7.0 10.5 9.5 8.5 8.5 4.0 3.5 1.5 0.0 0.0
Nấm men sử dụng đường để chuyển hóa thành rượu trong điều kiện yếm khí, quá trình này sinh ra khí CO2. Do đó dựa vào lượng khí CO2 sinh ra tại từng thời điểm
ta có thểđánh giá được khả năng lên men của các dòng nấm men.
khác biệt với các dòng nấm men còn lại. Khi dòng nấm men vào thì nấm men cần có
thời gian để thích nghi với môi trường mới nên sự lên men xảy ra khá chậm. Tuy
nhiên, sau khi dòng nấm men vào khoảng 1h thì đã có sự lên men đáng kể của