Dụng cụ thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm được sử dụng trong quá trình tiến hành đề tài gồm có: tủ sấy, phễu chiết, phễu lọc, máy cô quay chân không RE 400 Yamato, máy li tâm eppendorf, máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa Olympus, máy đo đường huyết tự động, cân kĩ thuật, micropipet, máy đo quang phổ…

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm và chuột ĐTĐ type 2 type 2

2.3.1.1. Phân nhóm động vật thí nghiệm

Động vật thí nghiệm là chuột nhắt trắng thuần chủng dòng Swiss khỏe mạnh được cân từng con, đánh dấu, phân lô ngẫu nhiên trước khi thí nghiệm.

Lương Thị Nụ 26 Lớp K37B - SP Sinh

a.Tạo mô hình chuột béo phì

- Lô nuôi thường (lô 1): Cho ăn chế độ bình thường (thức ăn chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW).

- Lô nuôi béo (lô 2 đến lô 12): Cho ăn thức ăn giàu lipid với thành phần được trộn từ nhiều loại thức ăn khác nhau.

Các lô chuột được theo dõi trong vòng 6 tuần, kiểm tra khối lượng hàng tuần.

b.Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2

Mô hình chuột ĐTĐ type 2 được xây dựng trên nhóm chuột béo phì kết hợp với tiêm STZ liều thấp.

Phương pháp:

Chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo trong 6 tuần ở trên. Sau 16h cho nhịn đói, tiến hành tiêm màng bụng liều đơn STZ (110mg/kg thể trọng) pha trong đệm citrate 0,01M ở pH = 4,3. Sau đó chúng được tiếp nhận nước và thức ăn bình thường. Nồng độ glucose huyết được kiểm tra trước và sau khi tiêm 3 ngày. Những con chuột có đường huyết xác định ≥ 18mmol/l và ổn định sẽ được chọn để uống cao các phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày.

c. Phân lô chuột thí nghiệm

Sau khi đã tạo được chuột béo phì và chuột ĐTĐ type 2 chúng tôi tiến hành phân lô chuột thí nghiệm như sau :

* Mô hình chuột béo phì

- Lô 1: Chuột nuôi thường (Lô đối chứng (chung cho cả hai mô hình))

- Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị

- Lô 3: Chuột béo phì điều trị bằng cao ethanol

- Lô 4: Chuột béo phì, điều trị bằng cao n - hexan

- Lô 5: Chuột béo phì, điều trị bằng cao chloroform

Lương Thị Nụ 27 Lớp K37B - SP Sinh * Mô hình chuột ĐTĐ

- Lô 7: Chuột ĐTĐ type 2, không điều trị

- Lô 8: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng thuốc metformin

- Lô 9: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao ethanol

- Lô 10: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao n - hexan

- Lô 11: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao chloroform

- Lô 12: Chuột ĐTĐ type 2, điều trị bằng cao ethylacetat

2.3.1.2. Tiến hành thí nghiệm

Trong quá trình thí nghiệm, các lô chuột đều được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm Hóa sinh - khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Chuột được cho ăn thức ăn tổng hợp có hàm lượng chất béo cao và uống nước bình thường. Các lô chuột được nuôi trong các lồng riêng biệt để tránh lây chéo có thể xảy ra qua đường hô hấp và tiếp xúc. Hàng ngày theo dõi, ghi chép diễn biến, kết quả thí nghiệm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Thời gian điều trị là 3 tuần với liều lượng cho uống là 2000mg dịch chiết/kg thể trọng/ngày. Cao của các phân đoạn dịch chiết được hoà vào nước ấm và cho chuột uống hàng ngày vào mỗi buổi sáng.Trước khi cho chuột uống các cao dịch chiết, chuột được nhịn đói nhằm tránh sự ảnh hưởng của thức ăn đến quá trình hấp thụ cao dịch chiết.

Trọng lượng và nồng độ glucose huyết của các lô chuột được theo dõi vào các thời điểm: trước khi tiến hành điều trị, sau điều trị 1, 2, 3 tuần.Vào ngày cuối cùng của thời gian thí nghiệm, sau khi kiểm tra glucose huyết, tiến hành lấy máu tổng số để xác định các chỉ số lipid huyết thanh.

2.3.2. Sử dụng phương pháp hóa sinh y dược để định lượng đường huyết và một số chỉ số hóa sinh liên quan tới rối loạn trao đổi lipid ở chuột. một số chỉ số hóa sinh liên quan tới rối loạn trao đổi lipid ở chuột.

2.3.2.1. Thử độc tính theo đường uống, xác định LD50

Xác định LD50 của dịch chiết hạt loài đậu xanh b ằng đường uống theo phương pháp Lorke [17]. Chuột nhịn đói trước 12 giờ thí nghi ệm được phân lô

Lương Thị Nụ 28 Lớp K37B - SP Sinh

ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần lên đến 8g/kg (thể tích và khối lượng tối đa cho phép). Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết hạt đậu xanh.

2.3.2.2. Phương pháp định lượng glucose huyết.

Máu dùng để định lượng glucose huyết là máu toàn phần lấy từ đuôi chuột. Định lượng glucose huyết bằng máy đo đường huyết tự động và bộ kít thử tương ứng (One Touch Ultra, Johnson & Johnson, USA).

Hình 2.3: Phƣơng pháp lấy máu đo glucose huyết Nguyên tắc:

Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương pháp quang học để định lượng glucose huyết.

+ Phản ứng 1: khi máu tiếp xúc với bề mặt của vùng phản ứng que thử, dưới xúc tác đặc hiệu của glucose oxidase (GOD) có trong kít thử, glucose trong máu phản ứng với oxy (không khí) tạo thành acid gluconic và hydro peroxide (H2O2).

+ Phản ứng 2: hydro peroxide vừa tạo ra sẽ phản ứng với O - Dianisidin tạo phức màu và được thiết bị đo quang học trong máy One Touch Ultra chuyển hóa định lượng biểu thị bằng số mmol/l hoặc mg/dl glucose.

Tiến hành:

Ấn nút điều khiển để khởi động máy. Gắn que thử vào máy. Dùng kim châm chuyên dụng châm vào mạch máu ở đuôi chuột, để máu chảy tự nhiên, thấm bỏ giọt đầu tiên, lấy giọt máu thứ 2. Mẫu máu dùng cho việc đo là 1µl, phải là giọt

Lương Thị Nụ 29 Lớp K37B - SP Sinh

máu tròn đầy, phủ kín giọt máu lên vùng phản ứng của que thử. Sau 5 giây, kết quả nồng độ đường huyết sẽ hiển thị trên màn hình.

2.3.2.3. Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL - c, LDL - c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh - Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô). Nguyên tắc xác định như sau:

a. Định lƣợng triglycerid

Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ 4 - aminoantipyrin và 4 - chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546 nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả.

b. Định lƣợng cholesterol toàn phần

Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của Quynonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4 - aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase. Các phản ứng:

Đo mật độ quang của Quynonimin ở bước sóng 546 nm (bằng máy Olympus AU400) so với ống chuẩn để tính kết quả.

Lương Thị Nụ 30 Lớp K37B - SP Sinh

c. Định lƣợng HDL - c

Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu. Bước thứ nhất cholesterol trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme đặc hiệu. Bước thứ hai cholesterol trong HDL được định lượng bằng phản ứng enzyme với sự có mặt của chất surfactant đặc hiệu cho HDL. Bước 1:

Bước 2:

d. Định lƣợng LDL - c. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

LDL - c được xác định kết quả theo công thức của Fridewald ( công thức nội suy) :

LDL - c = Choles toàn phần – [HDL - c + 0,45 TG].

2.3.3. Phương pháp xử lý thống kê toán học.

Chỉ số glucose huyết được so sánh giữa thời điểm trước và sau nghiên cứu; so sánh giữa các lô dùng thuốc và lô đối chứng ở cùng thời điểm.

* Tỷ lệ tăng glucose huyết được tính theo công thức

Tỷ lệ % tăng glucose huyết:

X1 – Tỷ lệ % tăng glucose huyết

A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá

Lương Thị Nụ 31 Lớp K37B - SP Sinh

Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t - test student với p < 0.05 có ý nghĩa thống kê.

* Tỷ lệ hạ glucose huyết, (TC, HDL- c, LDL- c, TG) được tính theo công thức

dưới đây

Tỷ lệ % hạ glucose huyết:

X2 – Tỷ lệ % hạ glucose huyết

A – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm ban đầu B – Chỉ số glucose huyết tại thời điểm đánh giá

Sự khác biệt được kiểm định bằng thuật toán t - test student với p < 0.05 có ý nghĩa thống kê.

Lương Thị Nụ 32 Lớp K37B - SP Sinh

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm và chuột đái tháo đƣờng type 2. đƣờng type 2.

3.1.1. Kết quả tạo mô hình chuột béo phì thực nghiệm.

Chuột nhắt trắng (Muss musculus) chủng Swiss (khối lượng ban đầu là 17 - 20g/con) được chia làm 12 lô.

Lô 1: cho ăn chế độ bình thường (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW). Lô 2 - 12: cho ăn thức ăn giàu lipid và cholesterol cao như bảng 2.2.

Sau 6 tuần nuôi theo chế độ trên, chúng tôi tiến hành cân khối lượng chuột. Kết quả sự thay đổi khối lượng chuột của lô nuôi thường và lô nuôi béo được thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.2.

Lương Thị Nụ 33 Lớp K37B - SP Sinh

Bảng 3.1. Khối lƣợng trung bình của hai nhóm chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dƣỡng khác nhau

Nhóm chuột

Ban đầu

Trọng lượng trung bình của chuột tại các thời điểm khác nhau (g)

Tu ần 1 Tu ần 2 Tu ần 3 Tu ần 4 Tu ần 5 Tu ần 6 Nhóm ăn thường 18.34 20.17 23.08 26.35 29.87 32.01 35.52 ±1.07 ±0.38 ±0.57 ±0.62 ±1.01 ±1.12 ±1.07 Nhóm ăn béo 18.56 24.07 29.25 36.19 42.09 48.63 53.71 ±1.02 ±1.83 ±1.51 ±1.94 ±1.78 ±2.35 ±2.62

Hình 3.2. Biểu đồ so sánh sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dƣỡng khác nhau trong 6 tuần (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Bảng 3.1 và hình 3.2 đã cho thấy rằng chuột được nuôi theo chế độ ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao có khả năng tăng về khối lượng lớn hơn rất nhiều so với chuột ăn thức ăn thường và sự sai khác này là có ý nghĩa thống kê với trị số p < 0.05. Cụ thể là:

Lương Thị Nụ 34 Lớp K37B - SP Sinh

Tại thời điểm ban đầu sự khác nhau về khối lượng không có ý nghĩa thống kê (p > 0.05).

Trong tuần đầu tiên, khi nuôi với chế độ thức ăn giàu lipid khối lượng chuột đạt 24.07g và đã có ý nghĩa thống kê toán học.

Tại thời điểm 21 ngày, khối lượng chuột nuôi béo đạt 36.19g tăng 37.34%; ở mức có ý nghĩa p < 0.05 so với lô đối chứng (26.35g).

Đến ngày thứ 35 khối lượng chuột nuôi béo đạt 48.63g tăng 51.92% với p < 0.05 so với lô chuột đối chứng nuôi thường (32.01g).

Kết thúc 42 ngày sau quá trình nuôi với chế độ thức ăn giàu chất béo, khối lượng chuột nuôi béo nặng 53.71g, tăng 51.21% (p < 0.05) so với lô đối chứng.

Đây là một kết quả khá khả quan, phù hợp với nhiều kết quả thực nghiệm trên chuột của các tác giả trong và ngoài nước. Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Liên và cộng sự, sau 6 tuần khối lượng của chuột nuôi béo tăng gấp 1.55 lần tương ứng 55.01% với chuột ăn thường [9]. Srinivasan K. và cộng sự trên dòng chuột Cống Sprague - Dawley cũng cho thấy khối lượng chuột sau 2 tuần ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao đã tăng hơn so với chuột ăn thức ăn thường là 25.11g [19]. Những nghiên cứu về chuyển hóa các chất ở tế bào và mô cho chúng ta thấy rằng khi tiêu thụ chất béo vượt quá nhu cầu năng lượng của cơ thể thì chất béo sẽ được tích tụ ở mô mỡ gây béo phì. Như vậy, chế độ ăn giàu chất béo bão hòa là một trong những yếu tố nguy cơ gây nên bệnh béo phì cũng như các bệnh mãn tính liên quan.

Qua đó có thể khẳng định chuột nuôi bằng thức ăn giàu chất béo đã trở thành chuột béo phì về khối lượng.

Tuy nhiên để có thêm cơ sở khẳng định chế độ dinh dưỡng giàu chất béo có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi lipid và carbohydrate ở chuột, chúng tôi tiến hành xét nghiệm một số chỉ số hóa sinh có liên quan tới rối loạn trao đổi lipid để xác định chuột có thực sự béo phì hay không và kết quả thu được như bảng 3.8.

Lương Thị Nụ 35 Lớp K37B - SP Sinh

Bảng 3.2. So sánh một số chỉ số lipid máu giữa chuột nuôi thƣờng và nuôi béo phì thực nghiệm

Nhóm chuột Các chỉ số lipid (mmol/l)

TC TG HDL-c LDL-c Glucose Nhóm ăn thường 4.34 ±0.32 1.75 ±0.25 1.41 ±0.21 2.46 ±0.37 5.85 ±0.33 Nhóm ăn béo 5.86* ±0.41 2.42* ±0.30 0.83* ±0.27 3.52* ±0.34 8.71* ±0.31 % thay đổi ↑35.02 ↑38.3 ↓41.13 ↑43.08 ↑48.9 (*): p < 0.05

Hình 3.3. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột

Kết quả ở bảng 3.2 và hình 3.3 cho thấy các lô chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao đều có rối loạn một số chỉ số lipid máu so với các lô chuột ăn thức ăn bình thường. Cụ thể:

Hàm lượng LDL - c trong máu chuột ăn thức ăn béo là 3.52 mmol/l, tăng 43.08% so với nhóm nuôi thường (2.46 mmol/l) với p < 0.05. Trái lại, HDL - c lại có sụt giảm mạnh, giảm tới 41.13 % so với chuột nuôi thường (1.41mmol/l), với

Lương Thị Nụ 36 Lớp K37B - SP Sinh

p < 0.05.

Hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid trong huyết thanh của nhóm chuột nuôi béo tương ứng tăng 35.02%, 38.3% so với nhóm chuột nuôi bằng thức ăn thường.

Hàm lượng glucose của chuột trong nhóm ăn thức ăn béo là 8.71 mmol/l, tăng 48.9% so với chuột thường (5.85mmol/l).

Như vậy, khi cho chuột ăn thức ăn có hàm lượng chất béo cao dẫn đến không chỉ tăng về khối lượng mà các chỉ số lipid như cholesterol tổng số, triglycerid, LDL - c cũng tăng một cách rõ rệt. Sự tăng cao nồng độ glucose huyết của chuột ăn thức ăn giàu chất béo đã chỉ ra rằng, ở nhóm chuột này đã có sự biểu hiện của hiện tượng kháng insulin. Đây là nguy cơ của chuột béo phì dẫn đến ĐTĐ type 2.

Kết quả này hoàn toàn phù hợp với quy luật thực tế và nghiên cứu của Srinivasan và cộng sự là chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cao trong thời gian dài rất dễ dẫn đến rối loạn trao đổi chất glucid - lipid [22].

Như vậy với các dẫn liệu khối lượng cơ thể, các chỉ số mỡ máu tăng cao bất thường, đồng thời theo quan sát của chúng tôi chuột nuôi béo hoạt động chậm chạp hơn chuột nuôi thường. Chúng tôi có thể kết luận rằng mô hình gây chuột béo phì bằng chế độ thức ăn giàu chất béo đã thành công. Chuột béo phì được tiếp tục sử dụng cho những nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2. Kết quả tạo mô hình chuột đái tháo đường type 2.

Hiện nay, có rất nhiều mô hình gây ĐTĐ thực nghiệm trên thế giới, các mô hình khác nhau sẽ sử dụng các phương pháp khác nhau và điều này phụ thuộc vào loại ĐTĐ (type 1, type 2), các dòng chuột khác nhau. Đối với mô hình ĐTĐ type 1 thông thường người ta tiêm STZ hoặc alloxan ở liều cao vào chuột mà không cần phải qua thời gian nuôi béo do tác dụng phá hủy hoàn toàn tế bào β của đảo tụy bởi STZ và alloxan . Đối với mô hình ĐTĐ type 2 lại tuỳ thuộc vào nhiều yếu tố như dòng chuột , thời gian nuôi , chế độ ăn thức ăn béo . Chuột

Lương Thị Nụ 37 Lớp K37B - SP Sinh

béo phì tiêm STZ hoặc alloxan liề u đơn, chuột béo phì tiêm STZ liều thấp kết hợp nicotineamide , chuột béo phì tiêm STZ liều thấp lặp lại .

Dựa trên những phương pháp đó, chúng tôi đã lựa chọn và tiến hành xây