2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.5.2.Một số nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới
Ở trong nƣớc các công trình nghiên cứu về Trâm lý phần lớn chỉ đề cập đến khía cạnh thực vật học và một số công dụng các bộ phận khác nhau của Trâm lý theo kinh nghiệm dân gian ( các nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi, Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi …), gần nhƣ chƣa có những nghiên cứu về hoá sinh học hay những nghiên cứu nhằm khai thác và sử dụng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong các bộ phận khác nhau của Trâm lý. Vì vậy cho đến nay, Trâm lý vẫn chỉ đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu chữa bệnh trong nhân dân theo kinh nghiệm dƣới dạng thô
39
Trên thế giới: Đặt điểm thực vật học của Trâm lý đã đƣợc nghiên cứu rõ. Ngƣời ta cũng đã thống kê khoảng 18 thứ tiếng khác nhau có tên gọi cùng chỉ cây Trâm lý. Về mặt hóa học, ngƣời ta đã nghiên cứu thành phần hoá học của hạt, vỏ thân và vỏ rễ của loài Syzygium Jambos (L.) Alston. Tại Ân Độ đã sử dụng một số bộ phận của loài Syzygium Jambos (L.) Alston để tách chiết và bào chế thành thực phẩm chức
40
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG
2.1.1. Thực vật
Hình 8. Quả và hạt Trâm lý (Syzygium jambos L. Alston)
Mẫu đã xác định thu hái ở Ý Yên, tỉnh Nam Định và đƣợc TS. Trần Văn Ơn, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội phân loại và xác định là loài Trâm lý (Syzygium
jambos L.Alston.). Bộ phận sử dụng là hạt quả, lá, vỏ thân, rễ đƣợc sấy khô, nghiền
nhỏ.
2.1.2. Động vật
+ Chuột nhắt trắng chủng Swiss 04 tuần tuổi (14-17g), Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp.
+ Thức ăn thƣờng tiêu chuẩn (Viện Vệ Sinh Dịch tễ TW); thức ăn giàu lipid với thành phần đƣợc phối trộn bằng nguyên liệu của Việt Nam, đƣợc đặt cho Viện vệ sinh Dịch tễ TW chế biến theo thành phần phân tích của viện Dinh dƣỡng Quốc gia và theo tài liệu của Srinivasan và đồng tác giả [12, 14, 18].
41
2.1.3. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm 2.1.3.1. Hoá chất
- STZ (streptozotocin) Sigma, ST. Louse - Silicage 60 (0,004 - 0,063mm) Merek
- Các loại dung môi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, n-hexan, chloroform, ethylacetat, toluen, aceton,… là các hoá chất tính khiết đƣợc mua của các hãng thƣơng mại Quốc tế có uy tín: Prolabo, Sigma, Merck,…
2.1.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Bộ máy Soxhlet chiếu mẫu của Đức
- Máy phân tích thành phần Lipid và Glucose máu AU 640(Olympus). - Một số máy móc cần thiết khác nhƣ: Voltex, máy ly tâm, máy khuấy từ, bể ổn nhiệt, bếp điện…
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý
Trâm lý đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 60-650
C và nghiền thành bột. 500 gam bột hạt quả đƣợc ngâm kiệt trong ethanol 90% ở nhiệt độ phòng. Cô cạn dịch chiết thô thu đƣợc cao ethanol. Cao ethanol sau khi hoà tan lại trong nƣớc cất đƣợc chiết qua hệ các dung môi có độ phân cự tăng dần: n-hexan-chloroform-ethylacetate. Cất loại dung môi thu đƣợc sau khi chiết thu lấy cao của các phân đoạn. Mô hình chiết rút nhƣ ở hình 9 dƣới đây.
42 BỘT TRÂM LÝ Cao ethanol Phân đoạn n- hexan Phân đoạn Cloroform Phân đoạn ethylacetate Phân đoạn nƣớc
Chiết EtOH (3 lần), cất loại dung môi dƣới áp suất giảm
Bổ sung nƣớc, bổ sung n- hexan
Lớp nƣớc, bổ xung cloroform
Lớp nƣớc, bổ xung ethylacetate
Hình 9. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ cây Trâm lý
43
2.2.2. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong cây Trâm lý bằng phƣơng pháp hoá học phƣơng pháp hoá học
2.2.2.1. Định tính flavonoid
Mẫu thử đƣợc pha trong ethnol với một lƣợng thích hợp, thêm vài giọt HCL đặc.
Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thuỷ trong vài phút. Phản ứng dƣơng tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào hai ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay lâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCL đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dƣơng tính. [5]
2.2.2.2. Định tính tanin
Mẫu thử cũng đƣợc pha nhƣ trên và làm các phản ứng:
Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào hai ống nghiệm : một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dƣơng tính khi thu đƣợc màu đỏ đậm.
Phản ứng với gelatin/ NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dƣơng tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
Phản ứng với acetate chì: Cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa. [5]
2.2.2.3. Định tính các polyphenol khác
Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử đƣợc pha nhƣ trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
44
Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0.5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử đƣợc pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dƣơng tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen. [5]
2.2.2.4. Định tính glycoside
Phản ứng Keller- Killian:
- Thuốc thử Keller- Killian
- Dung dịch A: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10% - Dung dịch B: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sumfuric đặc
Phƣơng pháp: cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. [5]
2.2.2.5. Định tính alkaloid
Mẫu thử đƣợc pha dung dịch acid acetic 2% với một lƣợng thích hợp để làm các phản ứng
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): Alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm.
Phản ứng thuốc thử vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nƣớc): Alkaloid phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): Alkloid phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ. [5, 11]
2.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp hiệu hạt quả để phân tách nhiều hợp chất hữu cơ. Cũng nhƣ nguyên tắc chung của mọi hệ thống sắc ký khác. Hệ thống sắc ký này cũng phân tách các chất dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động có thể có chất lỏng hoặc chất khí, đẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh và chất rắn hoặc chất lỏng. Mẫu phân tích chứa chứa các chất khác nhau với ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh. Nếu một chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn hơn trong pha tĩnh, ngƣợc lại một chất có ái lực
45
thấp với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn hơn trong pha tĩnh. khả năng hoà tan của chất trong pha động càng lớn thì chất càng di chuyển nhanh hơn do chuyển động của pha động. Nhƣ vậy các chất khác nhau đƣợc phân tích tách rời là do chúng có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. [5]
Chúng tôi tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254. hệ dung môi chạy sắc ký là TEAF: 5:3:1:1 (toluen- ethylacetate- acetone- acid formic). Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%.
Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b a: Khoảng di chuyển của chất nghiên cứu b: khoảng di chuyển của dung môi
2.2.4. Định lƣợng hợp chất polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau Ciocalteau
Cân 5 gam bột cây Trâm lý và ngâm trong 50 ml ethanol 80%, lọc thu dịch chiết.
Cân 10 mg mỗi loại cao ethnol, phân đoạn nƣớc, phân đoạn ethylacetate và hoà loãng trong 1ml ethanol, phân đoạn ethylacetate và hoà loãng trong 1ml ethanol 90%
Các dung dịch trên sau đó đƣợc hoà loãng ở các nồng độ thích hợp để làmphản ứng định lƣợng hợp chất phenolic theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau.
Định lƣợng hợp chất phenolic tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất phenolic trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 765 nm, lấy acid gallic làm chất chuẩn.
2.2.5. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm
46
Tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đƣờng thực nghiệm kết hợp với điều trị theo phƣơng pháp Srinivasan và cộng sự (2005) và kỹ thuật của Bhavana và cộng sự (2007).
Mô hình chuột thực nghiệm theo Bhavana và cộng sự (2007) chi tiết nhƣ sau: Chuột nhắt trắng chủng Swiss ( khối lƣợng ban đầu là 14 – 16g) đƣợc chia làm 9 lô nuôi, mỗi lô 10 con [12, 13, 14, 18]
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) (đối chứng âm)
Lô 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Chuột đƣợc cho ăn thức ăn giàu Lipid và Cholesterol cao.
Bảng 4. Thành phần thức ăn giàu lipit [22]
Thành phần Tỷ lệ %
Hydratcacbon 300
Lipd 350
Casein 250
Cholesterol 30
Vitamin và muối khoáng 30
Các thành phần khác, chất sơ 40
Sau 4 tuần tiến hành cân xác định trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh của chúng từ đó so sánh mực độ tăng trọng của hai chế độ nuôi khác nhau kể trên.
2.2.5.2. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm
Chuột gây béo phì thực nghiệm đƣợc điều trị trong 03 tuần bằng cao của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý bằng đƣờng uống hàng ngày vào buổi sáng theo mô hình thí nghiệm dƣới đây:
Lô 1: Tiếp tục nuôi ở chế độ bình thƣờng (lô đối chứng) Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị (đối chứng dƣơng A)
47
Lô 3: Chuột béo phì, đƣợc điều trị bằng thuốc tân dƣợc Metformin (Liều 500mg/kg thể trọng) (đối chứng dƣơng B)
Lô 4: Uống cao phân đoạn Etanol tổng số (800mg/kg) Lô 5: Uống cao phân đoạn n-Hexan tổng số (800mg/kg) Lô 6: Uống cao phân đoạn Cloroform.
Lô 7: Uống cao phân đoạn Ethylacetat tổng số.
Sau 03 tuần cho uống các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành xác định trọng lƣợng và lấy máu chuột để phân thích một số chỉ số hoá sinh: Glucose, Cholesterol, Triglyceride, HDLC, LDLC.
2.2.5.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột gây đái tháo đƣờng typ 2
Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm đƣợc gây đái tháo đƣờng Typ 2 bằng cách tiêm vào ổ bụng STZ liều thấp (120mg/kg thể trọng) nhƣ sau:
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) (đối chứng âm)
Lô 2: Chuột béo phì, không gây đái tháo đƣờng typ 2 (Đối chứng dƣơng) Lô 3, 4, 5, 6: Chuột béo phì gây đái tháo đƣờng typ 2 bằng STZ liều thấp (120mg/ kg thể trọng)
Theo dõi và nuôi chuột đái tháo đƣờng typ 2 bằng thức ăn thƣờng trong 1 tuần rồi điều trị bằng cao của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý bằng đƣờng uống hàng ngày vào buổi sáng theo mô hình thí nghiệm dƣới đây:
Lô 1: Chuột đƣợc nuôi ở chế độ bình thƣờng (lô đối chứng âm) Lô 2: Chuột béo phì, không dƣợc điều trị
Lô 3: Chuột đái tháo đƣờng typ 2, không đƣợc điều trị
Lô 4: Chuột đái tháo đƣờng typ 2 đƣợc điều trị bằng thuốc tân dƣợc Metformin
48
Lô 6: Uống cao phân đoạn Ethylacetate
Tiến hành đo nồng độ glucose huyết của chuột sau 03 tuần điều trị.
2.2.5.4. Định lƣợng đƣờng máu theo phƣơng pháp enzyme quang học
Nguyên lý: Xác định nồng độ glucose sau khi đã oxy hoá glucose bằng glucose oxidase (GOD), peroxidase đƣợc tạo thành tác dụng với 4-aminoantipyrin và phenol nhờ xúc tác của peroxidase (POD) tạo phức hợp màu quinoimin theo các phản ứng sau:
Glucose oxidase
Glucose + O2 Glucose acid + H2O2
Peroxydase
H2O2 + Phenol + 4-aminoantityrin Quinonimin (đỏ) + 4 H2O
Tính kết quả: đo mật độ quang học ở bƣớc sóng 546nm rồi so vơi glucose chuẩn
[10]
2.2.5.5. Định lƣợng triglycerid huyết thanh theo phƣơng pháp enzyme
Nguyên lý: thuỷ phân triglycerid bằng enzym lipase, định lƣợng glycerol giải phóng ra bằng phƣơng pháp đo màu của quinonimin tạo thành 4-aminoantipyryl và 4-cholorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:
Lipoprotein lipase
Triglycerid Glycerol + acid béo
Glycerol-3-phosphate-oxidase
Glycerol-3-phosphate +O2 Dihydroxyacetone phosphate + H2O2
peroxydase
2H2O2 + aminoamtipyrine + 4-cholesterol quinoneimine + HCl + 4H2O
Tính kết quả: Đo mật độ quang học quinonimin ở bƣớc sóng 546nm rồi so với
chuẩn. [10]
2.2.5.6. Định lƣợng cholesterol toàn phần trong huyết thanh theo phƣơng pháp enzym đo màu enzym đo màu
49
Nguyên lý: thuỷ phân cho cholesterol este bằng enzym cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO). Đo mật độ quang của quinonimin tạo tên từ phản ứng của hydrogen peroxide với – aminophenazone và phenol nhớ xúc tác của peroxidase. Các phản ứng:
CHE
Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid béo
CHO
Cholesterol + O2 Cholesterol -3-one + H2O2
peroxydase
2H2O2 + 4-aminophenazone + phenol Quinoneimine + H2O
Tính kết quả: So mật độ quang học của quinonimin với ống chuẩn [10]
2.2.5.7. Xử lý các số liệu: Sử dụng exel để xử lý số liệu.
2.2.6.1. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất 2.2.6.2. Quy trình phân lập các hợp chất 2.2.6.2. Quy trình phân lập các hợp chất
Cặn chiết ethyl acetate đƣợc tiến hành chạy sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel, hệ dung môi rửa giải CHOLESTEROL2Cl2/MeOH (100:0-50:50). Mỗi phân đoạn (20ml) đƣợc kiêm tra trên sắc ký bản mỏng, hệ dung môi CHCl3:MeOH (20:1 hoặc 9:1) với thuốc thử Ce(SO4)2trong H2SO4 65%, sấy khô và hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu. Các phân đoạn giống nhau đều gộp lại, tiếp tục sắc ký cột lặp lại nhiều lần với chất hấp thụ silica gel và rửa giải bằng hệ dung môi thích hợp.
2.2.6.3. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bảng mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60F254 và RP18F254 (Merck). Phát hiện chất bằng ánh sáng thƣờng với thuốc thử là Ce(SO4) trong H2SO4 65%, sấy khô và hơ nóng từ từ trên bếp điện đến khi hiện màu.
50
2.2.6.4. Sắc ký cột (CC)
Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp thụ là silica gel pha thƣờng cỡ hạt 0.04-0.063mm (230-400mesh) và 0.015-0.04mm, và silica gel pha đảo C18 LiChroprep RP-18,25-40 µm (Merck).
2.2.6.5. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hoá học của hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào các phƣơng pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà ngƣời ta sử dụng các phƣơng pháp cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất ngƣời ta còn phải dựa vào các phƣơng pháp bổ sung khác nhƣ chuyển hoá hoá học, kết hợp các phƣơng pháp sắc ký so sánh.
2.2.6.5.1. Xác định điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy BOTIUS (Heiztisch-Mikroskop, Đức) của Viện Hoá học các hợp chất tự nhiên.
2.2.6.5.2. Kỹ thuật phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy)
Kỹ thuật phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phƣơng pháp là dựa vào sự phân mảng ion của phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho cácion mảnh khác mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hoá học các hợp chất và đƣợc xác định trên máy AGILENT 1200 SERIES LC-MSD Trap spectrometer.
2.2.6.5.3. Kỹ thuật cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)