2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
2.2.6.5.Các phƣơng pháp xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ
Cấu trúc hoá học của hợp chất hữu cơ đƣợc xác định nhờ vào các phƣơng pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng hợp chất mà ngƣời ta sử dụng các phƣơng pháp cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu các phƣơng pháp phổ càng cao. Trong một số trƣờng hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất ngƣời ta còn phải dựa vào các phƣơng pháp bổ sung khác nhƣ chuyển hoá hoá học, kết hợp các phƣơng pháp sắc ký so sánh.
2.2.6.5.1. Xác định điểm nóng chảy
Điểm nóng chảy đƣợc đo trên máy BOTIUS (Heiztisch-Mikroskop, Đức) của Viện Hoá học các hợp chất tự nhiên.
2.2.6.5.2. Kỹ thuật phổ khối lƣợng (Mass Spectroscopy)
Kỹ thuật phổ khối lƣợng đƣợc sử dụng khá phổ biến để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ. Nguyên tắc chủ yếu của phƣơng pháp là dựa vào sự phân mảng ion của phân tử chất dƣới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Ngoài ion phân tử, phổ MS còn cho cácion mảnh khác mà dựa vào đó ngƣời ta có thể xác định đƣợc cơ chế phân mảnh và dựng lại đƣợc cấu trúc hoá học các hợp chất và đƣợc xác định trên máy AGILENT 1200 SERIES LC-MSD Trap spectrometer.
2.2.6.5.3. Kỹ thuật cộng hƣởng từ hạt nhân (Nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)
Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân là một phƣơng pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay đƣợc dùng để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất hƣu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của hợp chất kể cả cấu trúc lập thể của phân tử. Nguyên lý chung của các phƣơng pháp phổ NMR (phổ photon và cacbon) là sự cộng hƣởng khác nhau của các hạt
51
nhân từ (1H và 13C) dƣới tác dụng của các từ trƣờng ngoài. Sự cộng hƣởng khác nhau đƣợc biểu diễn bằng độ dịch chuyển hoá học và đƣợc xác định bằng máy Bruker AM500-FT-NMR spectrometer (Viện hoá học)
a. Phổ 1H-NMR
Trong 1H-NMR,độ dịch chuyển hoá học (δ) của các proton đƣợc xác định trong thang PPm từ 0 ppm đến 14ppm tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng đặc trƣng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng cũng nhƣ đặc trƣng riêng của từng phân tử. Mỗi loại proton cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và vì vậy chúng đƣợc biểu diễn bằng một độ dịch chuyển hoá học khác nhau. Dựa vào những đặc trƣng của độ dịch chuyển hoá học cũng nhƣ tƣơng tác spin coupling mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc cấu trúc hoá học của các hợp chất.
b. Phổ 13C-NMR
Phổ này cho tín hiệu vạch phổ của cacbon. Mỗi nguyên tử cacbon sẽ cộng hƣởng ở một trƣờng khác nhau và cho một tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo cho phổ 13C- NMR cũng đƣợc tính bằng ppm và với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton (0 ppm đến 24 ppm).
52
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT CÁC PHÂN ĐOẠN
Cây Trâm lý sau khi thu hái về đƣợc sấy khố, tán nhỏ và ngâm chiết 4 lần trong EtOH 90%. Sau đó đƣợc cất loại dung môi thu đƣợc căn EtOH, cặn này đƣợc chiết lần lƣợt qua các hệ dung môi có nồng độ phân cực giảm dần: n-hexan, CHCl3, EtOAc theo sơ đồ dƣới đây. Kết quả đƣợc trình bày nhƣ bảng 1
Hình 10. Sơ đồ chiết tách các phân đoạn của cây Trâm lý Bột cây Trâm lý
Cặn chiết Ethanol (200,5gam)
Cặn n-Hexan (70gam)
Cặn Chloroform(55,34gam)
Cặn Ethylacetat (80gam) Lớp nƣớc
Chiết EtOH (4 lần), cất loại dung môi dƣới áp suất giảm
Bổ sung nƣớc Bổ sung n- Hexam Lớp nƣớc Bổ sung chloroform Lớp nƣớc Bổ sung ethylacetat
53
Bảng 5. hiệu suất chiết qua cá phân đoạn dịch chiết của cây Trâm lý
Mẫu Khối lƣợng (g/1kg mẫu
ban đầu) %
Cao ethanol 200,5 20,05%
Cao c-hexan 70 7%
Cao Chloroform 55,34 5,5% (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cao ethylacetate 80 8%
Phƣơng pháp chiết có một ảnh hƣởng đến quan trọng đến việc phân lập các hợp chất. từ bảng có thấy với 1 kg mẫu ngâm chiết rút 4 lần với hỗn hợp EtOH: H2O 90% ở nhiệt độ phòng và chất loại dung môi với áp suất giảm trên máy cô quay chân không, đƣợc 200,5g cao EtOH , 70g cao h-hexan, 55,34g cao CHCl3, 80g cao EtOAc. Đây là hệ dung mỗi có hiệu suất chiết rút tốt, có khả năng chiết rút phần lớn thành phần hữu cơ có trong mẫu thực vật. Điều này đã đƣợc kiểm chứng qua các công trinh nghiên cứu thực nghiệm của nhiều tác giả khác nhau [10, 17, 22]. Với phƣơng pháp chiết này, chúng ta thu đƣợc các lớp chất có độ phân cực từ thấp đến cao. Điều này góp phần thuận lợi cho quá trình phân lập các hợp chất. Sau đó tiến hành chạy sắc ký lớp mỏng trên silicagel với hệ dung môi TEAF: 5 : 3 : 1 : 1 ( Toluen: EthylacetatL: Aceton: Formic acid). Ảnh sắc ký đồ đƣợc trình bày trên hình 11.
54
Hình 11. Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết của cây Trâm lý
Cột 1: cao cồng tổng số
Cột 2: phân đoạn dịch chiết n- hexan Cột 3: phân đoạn dịch chiết chloroform Cột 4: phân đoạn dịch chiết Ethylacetat
Nhìn trên bản sắc ký đồ thấy xuất hiện rất nhiều các băng vạch khác nhau có màu sắc đặc trƣng của các hợp chất polyphenol ( màu vàng – flavonoid, màu tím-
55
terpen, màu xanh-chlorophyl) và Ff khác nhau. Về mặt lý thuyết, mỗi vạch tƣơng ứng có một chất nhất định song về thực tế, có rất nhiều chất có cùng Rf, thậm chí chúng còn có màu sắc với nhau và nằm gối lên nhau ( Chẳng hạn các chất là đồng phân của nhau nhƣ: đồng phân quang học, đồng phân lập thể…). Do đố mỗi vạch chỉ có thể coi là có ít nhất mỗi chất trong nó.
Trong sắc ký lớp mỏng, các chất có độ phân cực yếu hơn và có khối lƣợng phận tử lớn hơn sẽ chạy chậm hơn và có Rf nhỏ hơn, ngƣợc lại các chất có độ phân cực mạnh và khối lƣợng phân tử nhỏ sẽ chạy nhanh hơn và có Rf lớn hơn. Thậm chí có nhiều chất còn không tách đƣợc nếu hệ dung môi không thích hợp, và không hiện màu nếu chất nhuộm màu không thích hợp. Trong những trƣờng hợp nhƣ vậy, chúng ta phải tìm hiểu thăm dò điều chỉnh độ phân cực của hệ dung môi chạy để tìm đƣợc hệ thích hợp. Một vấn đề nữa có thể đánh giá đƣợc đó là: đối với những vạch càng đậm thì chất có nồng độ càng lớn, còn vạch càng nhạt thì chất có nồng độ càng nhỏ. Từ bản sắcc ký ta có thể tính đƣợc các băng có các Rf. Kết quả Rf trình bày trong bảng 6
Bảng 6. Đặc điểm các băng vạch của các dịch chiết cây Trâm lý trên sắc ký đồ stt Cao cồn tổng số Phân đoạn n-hexan Phân đoạn chloroform Phân đoạn ethylacetate Rf Mầu sắc Rf Mầu sắc Rf Mầu sắc Rf Mầu sắc 1 0,971 đỏ nâu
2 0,903 đỏ nâu 0,903 Xanh 0,903 Đỏ nâu 0,903 Vàng
3 0,786 Xanh 0,786 Vàng 0,786 đỏ nâu
4 0,621 Vàng 0,621 Tím 0,621 Vàng
5 0,573 Nâu 0,573 Nâu 0,573 Tím 0,573 Tím
6 0,535 Xanh 0,535 Tím
7 0,505 Nâu vàng 0,505 Vàng 0,505 Nâu vàng 0,505 Nâu vàng
8 0,497 Nâu vàng 0,497 Nâu vàng
56 stt Cao cồn tổng số Phân đoạn n-hexan Phân đoạn chloroform Phân đoạn ethylacetate Rf Mầu sắc Rf Mầu sắc Rf Mầu sắc Rf Mầu sắc 10 0,379 Tím 0,379 Tím 0,379 Tím 0,379 Tím 11 0,301 Nâu 0,301 nâu 0,301 tím 0,301 Tím 12 0,252 xanh 0,252 tím
Nhƣ vậy, phân đoạn EtOH cho nhiều băng nhất (7 băng), tiếp theo là phân đoạn CHCl3 ( 6 băng), phân đoạn EtOAc (3 băng) và cáo n-hexan (2 băng). Có sự khác biệt về số băng của cao cồn so với các phân đoạn khác là do hàm lƣợng chất trong cao cồn chấm mẫu chạy sắc kí ít hơn so với các phân đoạn khác. Khi so sánh hệ số Rf của băng chúng tôi thấy có sự xuất hiện của 2 băng trên sắc ký đồ chung cho các 4 loại dịch chiếu đó là các bảng Rf=0,903, Rf=0,379, tuy nhiên khi so sánh mầu sắc của các băng trên trong các phân đoạn dịch chiết thì lại cho thấy có sự khác biệt phần nào.
Có lẽ vì tỷ lệ các nhóm chất trong các băng trên là khác nhau nên mức độ đậm nhạt của các băng cũng có sự khác biệt. Trong cồn tổng số và các phân đoạn n- hexan, chloroform có ít nhất 2 hợp chất có nồng độ lớn, còn phân đoạn dịch chiết ethylacetat có ít nhất 4 hợp chất có nồng độ lớn. Các phân đoạn dịch chiết có số lƣợng hợp chất tƣơng đối lớn, do vậy đây là cơ sở để tiến hành đánh giá các hoạt tính khác nhau của cây Trâm lý
3.2. ĐỊNH TÍNH FLAVONOID BĂNG CÁC PHẢN ỨNG HOÁ HỌC ĐẶC TRƢNG
Tiến hành các phản ứng định tính flavonoid bằng các phản ứng hoá học đặc trƣng đã nêu ở phần phƣơng pháp chƣơng 2. Phản ứng dƣơng tính để hiện qua màu sắc đặc trƣng dễ dàng quan sát bằng mắt thƣờng. Kết quả định tính đƣợc trình bày trong bảng 3
Bảng 7. Thành phần một số hợp chất tự nhiên trong dịch chiết EtOAc từ cây Trâm lý
57
Dịch chiết
Thuốc thử
NaOH H2SO4 FeCl3 Vanilin/HCl Dự đoán sự có mặt của Flavonoid EtOH + +++ ++ + Chalcon, auron, catechin n-hexan + - - - - CHCl3 + - - - - EtOAc +++ +++ ++ + Chalcon, auron, catechin (+): phản ứng dương tính ; (-): phản ứng âm tính
Từ bảng kết quả định tính cho thấy dịch chiết tổng EtOH cây Trâm lý cho phản ứng dƣơng tính (+) với cả 4 loại thuốc thử chứng tỏ sự có mặt của flavonoid Sau khi chiết phân lớp bằng các loại dung môi khách nhau thì phần dịch chiết bằng EtOAc cho phản ứng dƣơng tính mạnh hơn cả, điều này chứng tỏ thành phần flavonoid của cây Trâm lý chủ yếu trong dịch chiết EtOAc. Các phản ứng cho màu đặc trƣng có thể cho phép dự đoán sự có mặt của một số flavonoid nhƣ:
Chancol và aurol cho màu đỏ nâu với acid sulphuric, catechin cho màu đỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
son với dung dịch vanillin 1% trong HCl đặc, flavon và flavonol cho màu vàng đậm với H2SO4. Mức độ đậm nhạt của màu phản ứng có thể kết luận rằng sự có mặt của các hợp chất đặc trƣng trong phân lớp chiết đó là có nhiều hay ít.
3.3. ĐỊNH LƢỢNG HỢP CHẤT POLYPHENOL TỔNG SỐ
Định lƣợng polyphenol tổng số nhằm xác định hàm lƣợng của nó trong bột nguyên liệu khô khi chiết rút bằng ethanol 90% và trong các phân đoạn dịch chiết của cây Trâm lý. Kết quả trình bày trên bảng 4
Bảng 8. Hàm lƣợng hợp chất polyphenol tổng số trong các chế phẩm từ cây Trâm lý
58 tổng số/10g bột khô mẫu (mg) Polyphenol (%) Cao ethanol 95,5 9,55%
Phân đoạn ethylacetate 153,9 15,39%
Phân đoạn n-hexan 20,8 2,08%
Phân đoạn CHCl3 25,2 2,52%
Từ bảng số liệu cho thấy hàm lƣợng polyphenol tổng số có nhiều nhất trong phân đoạn EtOAc tới 15,39% só với 10g bột mẫu khô ban đầu. Tiếp đến trong cao EtOH là 9,55%. Còn lại trong phân đoạn n-hexan và phân đoạn CHCl3 lần lƣợt là 2,08%, 2,52%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với phần định tính. Flavonoid là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học mà phân đoạn EtOAc và cao cột tổng số qua định tính, định lƣợng sắc ký lớp mỏng thấy có chứa nhiều hợp chất lavonoid. Chính vì thế chúng tôi sử dụng hai phân đoạn dịch chiết này để nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của nó trên mô hình chuột gây ĐTĐ thực nghiệm bằng STZ
3.4 TÌM HIỂU TÁC DỤNG CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT TỪ HẠT QUẢ TRÂM LÝ LÊN TRỌNG LƢỢNG VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ HOÁ SINH QUẢ TRÂM LÝ LÊN TRỌNG LƢỢNG VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ HOÁ SINH TRÊN MÔ HÌNH CHUỘT NUÔI BÉO PHÌ THỰC NGHIỆM
3.4.1. Kết quả nuôi chuột trên mô hình nuôi béo phì thực nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss 3 tuần (14-17g) Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp, đƣợc phân đoạn 9 lô, nuôi với chế độ thức ăn khác nhau:
+ Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) (đối chứng âm)
+ Lô 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Chuột đƣợc cho ăn thức ăn giàu Lipid và Cholesterol cao.
Sau 4 tuần nuôi chúng tôi tiến hành xác định trọng lƣợng của các lô chuột thí nghiệm. Kết quả thu đƣợc nhƣ bảng 9.
59
Bảng 9. Trọng lƣợng trung bình các lô chuột thí nghiệm nuôi với các chế độ thức ăn khác nhau Lô M0(g) M1 (g) M2 (g) M3 (g) M4 (g) Tỷ lệ tăng trọng lƣợng sau 4 tuần (%) Tỷ lệ tăng trọng lƣợng sau 4 tuần giữa lô thƣờng và lô béo (%) Lô ăn thƣờng 14,5 21,5 28,2 32,8 35,6 ↑246 % ↑172 % Lô ăn béo 14,3 27,7 39,2 47,1 50,5 ↑353 %
Mn: trọng lƣợng chuột của tuần nuôi thứ n (coi tuần trƣớc ngày mua về là tuần nuôi thứ 0)
Hình 12. Biểu đồ trọng lƣợng trung bình các lô chuột thí nghiệm nuôi với các chế độ thức ăn khác nhau sau 4 tuần nuôi.
Từ bảng kết quả và biểu đồ trên ta có thể thấy, trọng lƣợng các chuột lô thí nghiệm nuôi bằng thức ăn giàu lipid sau 4 tuần tăng cao hơn hẳn so với lô nuôi
14.5 21.5 28.2 32.8 35.6 14.3 27.7 39.2 47.1 50.5 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0
Tuần 0 Tuần 1 Tuần 2 Tuần 3 Tuần 4
Trọng lượng
(g) Lô ăn thường
60
bằng thức ăn thông thƣờng. Cả 8 lô (lô 2- lô 9) cho ăn thức ăn giàu lipid có trọng lƣợng trung bình tăng tƣơng đƣơng nhau (tăng 353 % so với trọng lƣợng ban đầu) và tăng nhanh hơn nhiều hơn so với lô 1 (tăng 170 %) (mức ý nghĩa 0,01). Dựa vào kết quả thu đƣợc chúng tôi có thể kết luận loại thức ăn giàu lipid này có tác dụng làm tăng trọng lƣợng chuột mạnh hơn nhiều so với thức ăn thông thƣờng. Mô hình gây béo phì thực nghiệm trên chuột cơ bản đã thành công về mặt trọng lƣợng.
61
Hình14. Hình ảnh chuột nuôi ở hai chế độ ăn khác nhau
Để kiểm tra mức độ tăng trọng của các lô chuột thí nghiệm là do ảnh hƣởng của chế độ nuôi hay do sự tăng trọng bình thƣờng của các cá thể, chúng tôi tiến hành phân tích, so sánh một số chỉ số hoá sinh của lô chuột gây béo phì thực nghiệm và lô chuột thƣờng. Kết quả thu đƣợc từ bảng 10 và hình 14.
62 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 10. Một số chỉ số hoá sinh của lô chuột gây béo phì thực nghiệm và lô thƣờng
Các chỉ số Lô gây béo phì
thực nghiệm Lô nuôi thƣờng Tỷ lệ %
Glucose 7,6 ± 0,2 6,3 ± 0,14 ↑21%
Cholesterol 4,11 ± 0,32 2,48 ± 0,25 ↑66%
Triglycerid 1,50 ± 0,16 0,97 ± 0,07 ↑55%
HDLC 1,13 ± 0,02 2,00 ± 0,21 ↓44%
LDLC 1,86 ± 0,23 0,64 ± 0,11 ↑191%
Hình 15. Biểu đồ một số chỉ số hoá sinh của lô chuột gây béo phì thực nghiệm và lô thƣờng 6.3 2.48 0.97 2 0.64 7.6 4.11 1.5 1.13 1.86 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Glucose Cholesterol Triglycerid HDLC LDLC
Lô ăn thường Lô ăn béo
63
Nhận xét: Các chỉ số glucose, cholesterol, triglyceride, LDLC của lô chuột gây béo phì thực nghiệm cao hơn lô chứng lần lƣợt là 21%, 66%, 55%, 191% , và chỉ số LDLC của lô chuột gây béo phì thực nghiệm giảm 44% so với lô chứng. Nhƣ vậy, thức ăn giàu lipid đã làm thay đổi các chỉ số hoá sinh (glucose, cholesterol, triglyceride, HDLC, LDLC) của chuột so với lô đối chứng.
Nhƣ vậy ta có thể kết luận hiện tƣợng tăng trọng lƣợng của chuột nuôi béo phì thực nghiêm cao hơn so với chuột bình thƣờng là do chế độ nuôi dƣỡng khác nhau gây ra. Mô hình nuôi béo phì thực nghiệm đã bƣớc đầu cho kết quả khả quan và đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Tìm hiểu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm
Để nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ cấy Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hóa sinh trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm, tiến hành điều trị chuột béo phì trong 03 tuần bằng cách cho chuột uống cao pha trong