2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
1.3.4. Tác hại của đái tháo đƣờng
Đái tháo đƣờng là bệnh lý rối loạn chuyển hóa thƣờng gặp, bệnh nếu không đƣợc điều trị tốt và quản lý qua trình điều trị chặt chẽ sẽ xuất hiện nhiều biến chứng trầm trọng cả cấp tính và mạn tính nguy hiểm tới ngƣời bệnh, đặc biệt là các biến chứng mạn tính nhƣ mắt, tim mạch, thận, làm giảm khả năng lao động, giảm tuổi thọ và chất lƣợng sống của ngƣời bệnh.
1.4. STREPTOZOTOCIN [12, 14,18]
Streptozotocin (STZ:2-deoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido)-D-glucopyranose) là chất có hoạt tính chống ung thƣ đƣợc chiết xuất từ nấm Streptomyces achromogens. Khả năng gây ĐTĐ của STZ đã đƣợc một phòng thí nghiệm của Upjohn phát hiện vào năm 1963. Kể từ đó, STZ đƣợc sử dụng rộng rãi trong mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 phục vụ trong nghiên cứu về thuốc.
Tùy vào liều lƣợng STZ và cách thức tiến hành ngƣởi ta có thể gây mô hình động vật ĐTĐ type 1 và type 2 trên chuột cồng trƣởng thành và với liều 100-150 mg/kg STZ gây ĐTĐ type 1 và type 2 trên chuột nhắt trƣởng thành. Để tạo mô hình ĐTĐ type 2, ngƣời ta có thể gây bệnh dễ dàng bằng cách tiêm STZ liều 100 mg/kg trên chuột cống vào ngày đầu tiên khi sinh hoặc bằng cách nuôi chuột với chế độ dinh dƣỡng giàu lƣợng mỡ sau đó tiêm STZ liều 50-100mg/kg [16, 27].
36
Hình 6. Cấu trúc Streptozocin
STZ đƣợc nhận biết và xâm nhập vào tế bào ß qua kênh vận chuyển glucose GLUT2. Hoạt động của nó trong tế bào làm tổn thƣơng và alkyl hóa AND và cuối cùng dẫn tới hoại tử tế bào. Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí O6 của guanine.
N Aconitase XO O2 H2 OF N ONO
DNA damage Poly (ADP)
STZ
37
Hình7. Cơ chế gây độc của STZ lên tế bào ß của tụy đảo chuột MIT-ty thể, XOD – xanthine oxidase ß [25]
STZ tạo ra nitric oxdie (NO) làm tổn thƣơng AND của té bào ß. Mặt khác, hoạt động của NO làm ức chế chu trình Krebs, giảm tiêu thụ oxy trong ty thể từ đó làm giảm mạnh sự sản xuất ATP và tổn hại đến nucleotit của tế bào. Đồng thời phân tử này còn ức chế hoạt tính enzyme aconitase. Mặt khác, sự tăng cƣờng loại bỏ gốc phosphate của ATP sẽ bổ sung cơ chất cho xanthine oxidase ( hoạt tính enzyme này rất cao trong tế bào ß ) và tăng cƣờng sản xuất acid uric. Sau đó, xanthine oxidase xúc tác phản ứng tạo thành anio superoxyde (O2). Cuối cùng anio superoxyde sinh ra hydrogen peroxid (H2O2) và gốc hydroxyl (OH). Các dạng oxy phản ứng (reactive oxygen species) này cũng tập trung phân hủy AND và gây ra những thay đổi bất lợi cho tế bào. NO và các dạng oxy hoạt động còn có thể tạo thành peroxynitrate (ONOO) có độc tính cao. Tổn thƣơng AND gây ra bởi STZ làm tăng cƣờng quá trình trùng hợp ADP (poly ADP-ribosylation) dẫn đến làm mất NAD+, xa hơn nó phá hủy ATP dự trữ và sau đó ức chế tổng hợp và tiết insulin của tế bào ß ( hình 7)
1.5. Cây Trâm
1.5.1. Thực vật học [7]
Họ Trâm (Myrtaceae) gồm có 3 chi phân bổ ở các xứ nhiệt đới cực, lục địa tới New Zealand.Ở nƣớc ta có 2 chi: Freycmetia và Syzygium.
38
Đối tƣợng nghiên cứu trong đề tài này là loại Syzygium Jambos (L.) Alston
có những đặc điểm sau:
Miêu tả: Cây gỗ có kích thƣớc trung bình (10-12m). Lá hình ngọn giáo, hơi thon hẹp ở gốc, thon dài và mảnh ở phía đầu, cứng, có điểm tuyến trong suốt, dài 13-20cm, rộng 3-5cm; cuống lá ngắn. Hoa trắng hay xanh xanh, to, thành chùm ít hoa ở ngọn. Quả mọng, nạc, xốp, ít nƣớc, ngọt, thơm. Hạt 1-2, xám. Quả có dạng quả táo, màu trắng vàng, có nhuốm hồng nhiều hay ít, có nạc trắng, ít ngọt, mùi thơm của hoa hồng. Thƣờng ra hoa vào tháng 2-5, kết quả vào tháng 6-8
Phân bổ: Loài phân bổ rộng Ấn Độ - Malaixia, cho tới Inđônêxia. Cũng đƣợc trồng ở nhiều xứ nhiệt đới. Ở nƣớc ta, thƣờng thấy mọc ở những nơi ẩm, ven suối, từ Hà Tây, Hà Bắc, Nam Hà, Nam Định Ninh Bình, Sơn La, Nghệ An, Hà Tĩnh cho tới các tỉnh phía Nam.
Thành phần hoá học của hoa Syzygium Jambos (L.) Alston: Trong 100g phần ăn đƣợcc của quả có: 84,80g nƣớc, 0,5-0,8g protein, 0,2-0,3g chất béo, 9,7-14,2g carbohydrat, 1-2g xơ, 123-235IU caroten, 0,55-1,04mg phƣc hợp vitamin B và vitamin C 3-37mg. Nạc quả chứa hàm lƣợng pectin cao. Trong hạt quả còn có các acid amin tự do. Tinh dầu chiết xuất từ lá chứa 27% dl -pinen và 24% l-limonen, 2 monoterpen có vòng. Các bộ phận khác của cây, nhƣ hạt, lá, thân, rễ và vỏ đều có độc, do có alcaloid jambosin và acid hydrocyanic. Lá và vỏ còn chứa tanin, một oleorsin và một lƣợng nhỏ alcaloid.
1.5.2. Một số nghiên cứu trong nƣớc và trên thế giới [7, 15]
Ở trong nƣớc các công trình nghiên cứu về Trâm lý phần lớn chỉ đề cập đến khía cạnh thực vật học và một số công dụng các bộ phận khác nhau của Trâm lý theo kinh nghiệm dân gian ( các nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi, Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi …), gần nhƣ chƣa có những nghiên cứu về hoá sinh học hay những nghiên cứu nhằm khai thác và sử dụng các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học trong các bộ phận khác nhau của Trâm lý. Vì vậy cho đến nay, Trâm lý vẫn chỉ đƣợc sử dụng làm dƣợc liệu chữa bệnh trong nhân dân theo kinh nghiệm dƣới dạng thô
39
Trên thế giới: Đặt điểm thực vật học của Trâm lý đã đƣợc nghiên cứu rõ. Ngƣời ta cũng đã thống kê khoảng 18 thứ tiếng khác nhau có tên gọi cùng chỉ cây Trâm lý. Về mặt hóa học, ngƣời ta đã nghiên cứu thành phần hoá học của hạt, vỏ thân và vỏ rễ của loài Syzygium Jambos (L.) Alston. Tại Ân Độ đã sử dụng một số bộ phận của loài Syzygium Jambos (L.) Alston để tách chiết và bào chế thành thực phẩm chức
40
CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG
2.1.1. Thực vật
Hình 8. Quả và hạt Trâm lý (Syzygium jambos L. Alston)
Mẫu đã xác định thu hái ở Ý Yên, tỉnh Nam Định và đƣợc TS. Trần Văn Ơn, Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội phân loại và xác định là loài Trâm lý (Syzygium
jambos L.Alston.). Bộ phận sử dụng là hạt quả, lá, vỏ thân, rễ đƣợc sấy khô, nghiền
nhỏ.
2.1.2. Động vật
+ Chuột nhắt trắng chủng Swiss 04 tuần tuổi (14-17g), Viện Vệ sinh Dịch tễ TW cung cấp.
+ Thức ăn thƣờng tiêu chuẩn (Viện Vệ Sinh Dịch tễ TW); thức ăn giàu lipid với thành phần đƣợc phối trộn bằng nguyên liệu của Việt Nam, đƣợc đặt cho Viện vệ sinh Dịch tễ TW chế biến theo thành phần phân tích của viện Dinh dƣỡng Quốc gia và theo tài liệu của Srinivasan và đồng tác giả [12, 14, 18].
41
2.1.3. Hoá chất và dụng cụ thí nghiệm 2.1.3.1. Hoá chất
- STZ (streptozotocin) Sigma, ST. Louse - Silicage 60 (0,004 - 0,063mm) Merek
- Các loại dung môi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, n-hexan, chloroform, ethylacetat, toluen, aceton,… là các hoá chất tính khiết đƣợc mua của các hãng thƣơng mại Quốc tế có uy tín: Prolabo, Sigma, Merck,…
2.1.3.2. Dụng cụ thí nghiệm
- Bộ máy Soxhlet chiếu mẫu của Đức
- Máy phân tích thành phần Lipid và Glucose máu AU 640(Olympus). - Một số máy móc cần thiết khác nhƣ: Voltex, máy ly tâm, máy khuấy từ, bể ổn nhiệt, bếp điện…
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tách chiết các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý
Trâm lý đƣợc sấy khô ở nhiệt độ 60-650
C và nghiền thành bột. 500 gam bột hạt quả đƣợc ngâm kiệt trong ethanol 90% ở nhiệt độ phòng. Cô cạn dịch chiết thô thu đƣợc cao ethanol. Cao ethanol sau khi hoà tan lại trong nƣớc cất đƣợc chiết qua hệ các dung môi có độ phân cự tăng dần: n-hexan-chloroform-ethylacetate. Cất loại dung môi thu đƣợc sau khi chiết thu lấy cao của các phân đoạn. Mô hình chiết rút nhƣ ở hình 9 dƣới đây.
42 BỘT TRÂM LÝ Cao ethanol Phân đoạn n- hexan Phân đoạn Cloroform Phân đoạn ethylacetate Phân đoạn nƣớc
Chiết EtOH (3 lần), cất loại dung môi dƣới áp suất giảm
Bổ sung nƣớc, bổ sung n- hexan
Lớp nƣớc, bổ xung cloroform
Lớp nƣớc, bổ xung ethylacetate
Hình 9. Mô hình chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ cây Trâm lý
43
2.2.2. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên trong cây Trâm lý bằng phƣơng pháp hoá học phƣơng pháp hoá học
2.2.2.1. Định tính flavonoid
Mẫu thử đƣợc pha trong ethnol với một lƣợng thích hợp, thêm vài giọt HCL đặc.
Phản ứng Shinoda: Cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài mảnh Mg và đun trên nồi cách thuỷ trong vài phút. Phản ứng dƣơng tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
Phản ứng với acid sunfuric: Cho dung dịch mẫu vào hai ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay lâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
Phản ứng định tính catechin: Nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCL đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dƣơng tính. [5]
2.2.2.2. Định tính tanin
Mẫu thử cũng đƣợc pha nhƣ trên và làm các phản ứng:
Phản ứng với vanilin: Chia dung dịch mẫu vào hai ống nghiệm : một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dƣơng tính khi thu đƣợc màu đỏ đậm.
Phản ứng với gelatin/ NaCl: Cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dƣơng tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
Phản ứng với acetate chì: Cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện kết tủa. [5]
2.2.2.3. Định tính các polyphenol khác
Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử đƣợc pha nhƣ trên. Chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
44
Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0.5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử đƣợc pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dƣơng tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen. [5]
2.2.2.4. Định tính glycoside
Phản ứng Keller- Killian:
- Thuốc thử Keller- Killian
- Dung dịch A: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10% - Dung dịch B: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sumfuric đặc
Phƣơng pháp: cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng dƣơng tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. [5]
2.2.2.5. Định tính alkaloid
Mẫu thử đƣợc pha dung dịch acid acetic 2% với một lƣợng thích hợp để làm các phản ứng
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): Alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm.
Phản ứng thuốc thử vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong nƣớc): Alkaloid phản ứng cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): Alkloid phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ. [5, 11]
2.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng là phƣơng pháp hiệu hạt quả để phân tách nhiều hợp chất hữu cơ. Cũng nhƣ nguyên tắc chung của mọi hệ thống sắc ký khác. Hệ thống sắc ký này cũng phân tách các chất dựa trên sự phân bố các chất giữa hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha động có thể có chất lỏng hoặc chất khí, đẩy mẫu qua vùng chứa pha tĩnh và chất rắn hoặc chất lỏng. Mẫu phân tích chứa chứa các chất khác nhau với ái lực khác nhau đối với pha động và pha tĩnh. Nếu một chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ di chuyển chậm hơn hơn trong pha tĩnh, ngƣợc lại một chất có ái lực
45
thấp với pha tĩnh sẽ di chuyển nhanh hơn hơn trong pha tĩnh. khả năng hoà tan của chất trong pha động càng lớn thì chất càng di chuyển nhanh hơn do chuyển động của pha động. Nhƣ vậy các chất khác nhau đƣợc phân tích tách rời là do chúng có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. [5]
Chúng tôi tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254. hệ dung môi chạy sắc ký là TEAF: 5:3:1:1 (toluen- ethylacetate- acetone- acid formic). Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%.
Xác định hệ số Rf theo công thức: Rf = a/b a: Khoảng di chuyển của chất nghiên cứu b: khoảng di chuyển của dung môi
2.2.4. Định lƣợng hợp chất polyphenol tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau Ciocalteau
Cân 5 gam bột cây Trâm lý và ngâm trong 50 ml ethanol 80%, lọc thu dịch chiết.
Cân 10 mg mỗi loại cao ethnol, phân đoạn nƣớc, phân đoạn ethylacetate và hoà loãng trong 1ml ethanol, phân đoạn ethylacetate và hoà loãng trong 1ml ethanol 90%
Các dung dịch trên sau đó đƣợc hoà loãng ở các nồng độ thích hợp để làmphản ứng định lƣợng hợp chất phenolic theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau.
Định lƣợng hợp chất phenolic tổng số theo phƣơng pháp Folin- Ciocalteau. Phƣơng pháp này đƣợc thực hiện dựa trên nguyên tắc các hợp chất phenolic trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 765 nm, lấy acid gallic làm chất chuẩn.
2.2.5. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm
46
Tạo mô hình chuột béo phì và đái tháo đƣờng thực nghiệm kết hợp với điều trị theo phƣơng pháp Srinivasan và cộng sự (2005) và kỹ thuật của Bhavana và cộng sự (2007).
Mô hình chuột thực nghiệm theo Bhavana và cộng sự (2007) chi tiết nhƣ sau: Chuột nhắt trắng chủng Swiss ( khối lƣợng ban đầu là 14 – 16g) đƣợc chia làm 9 lô nuôi, mỗi lô 10 con [12, 13, 14, 18]
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) (đối chứng âm)
Lô 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: Chuột đƣợc cho ăn thức ăn giàu Lipid và Cholesterol cao.
Bảng 4. Thành phần thức ăn giàu lipit [22]
Thành phần Tỷ lệ %
Hydratcacbon 300
Lipd 350
Casein 250
Cholesterol 30
Vitamin và muối khoáng 30
Các thành phần khác, chất sơ 40
Sau 4 tuần tiến hành cân xác định trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh của chúng từ đó so sánh mực độ tăng trọng của hai chế độ nuôi khác nhau kể trên.
2.2.5.2. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột nuôi béo phì thực nghiệm
Chuột gây béo phì thực nghiệm đƣợc điều trị trong 03 tuần bằng cao của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý bằng đƣờng uống hàng ngày vào buổi sáng theo mô hình thí nghiệm dƣới đây:
Lô 1: Tiếp tục nuôi ở chế độ bình thƣờng (lô đối chứng) Lô 2: Chuột béo phì, không điều trị (đối chứng dƣơng A)
47
Lô 3: Chuột béo phì, đƣợc điều trị bằng thuốc tân dƣợc Metformin (Liều 500mg/kg thể trọng) (đối chứng dƣơng B)
Lô 4: Uống cao phân đoạn Etanol tổng số (800mg/kg) Lô 5: Uống cao phân đoạn n-Hexan tổng số (800mg/kg) Lô 6: Uống cao phân đoạn Cloroform.
Lô 7: Uống cao phân đoạn Ethylacetat tổng số.
Sau 03 tuần cho uống các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành xác định trọng lƣợng và lấy máu chuột để phân thích một số chỉ số hoá sinh: Glucose, Cholesterol, Triglyceride, HDLC, LDLC.
2.2.5.3. Nghiên cứu tác dụng hạ đƣờng huyết của các phân đoạn dịch chiết từ cây Trâm lý lên trọng lƣợng và một số chỉ số hoá sinh trên mô hình chuột gây đái tháo đƣờng typ 2
Chuột sau khi nuôi bằng mô hình gây béo phì thực nghiệm đƣợc gây đái tháo đƣờng Typ 2 bằng cách tiêm vào ổ bụng STZ liều thấp (120mg/kg thể trọng) nhƣ sau:
Lô 1: Cho ăn chế độ bình thƣờng (thức ăn của Viện Vệ sinh Dịch tễ TW) (đối chứng âm)
Lô 2: Chuột béo phì, không gây đái tháo đƣờng typ 2 (Đối chứng dƣơng) Lô 3, 4, 5, 6: Chuột béo phì gây đái tháo đƣờng typ 2 bằng STZ liều thấp