2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
3.5.Phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Từ những kết quả trên, chúng tôi nhận thấy phân đoạn ethylacetat có khả năng làm giảm trọng lƣợng ở chuột béo phì và nồng độ glucose huyết ở chuột đái tháo đƣờng typ 2 là rất tốt, gần tƣơng đƣơng với metformin. Để hiểu rõ hơn thành phần hóa học của phân đoạn dịch chiết ethylacetat, chúng tôi tiến hành phân lập và xác định cấu trúc hóa học của một trong số các hợp chất trong phân đoạn này.
Cặn chiết ethylacetat (8g) đƣợc phân lập từ cột sắc ký pha thƣờng với hệ dung môi Clorofoc: methanol tỉ lệ (50:1, 10:1, 1:1,…), thu đƣợc 4 phân đoạn A, B, C, D. Phân đoạn B tiếp tục đƣợc tiến hành sắc ký trên cột pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải clorofoc: methanol tỉ lệ (8: 1,…) thu đƣợc hợp chất 1 có dạng bột màu vàng. Phổ ESI-MS của 1 xuất hiện tín hiệu tại m/z 303 [M+H]+ ở positive và m/z
301 [M-H]- ở negative gợi ý cho số khối của 1 là 302 với công thức cộng C15H10O7. Phổ 1H-NMR của 1 cho thấy đây là một hợp chất flavonoid với vùng các tín hiệu H từ 6,18 ppm đến 7,64 ppm. Sự xuất hiện 3 tín hiệu proton của vòng thơm với hệ tƣơng tác spin ABX tại H 7,42 (1H, d, J = 2,0 Hz), H 6,88 (1H, d, J = 8,5 Hz) và H 7,64 (1H, dd, J = 2,0, 8,5 Hz) cho thấy 2 nhóm thế vào vòng B phải nằm ở vị trí C-3’ và C-4’. Trên vòng A, các giá trị H 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz) và H 6,38 (1H, d, J = 2,0 Hz) khẳng định vòng A bị thế 4 vị trí.
80
Phổ proton của hợp chất 1
Hình 25. Phổ Proton của hợp chất 1
Phổ 13C-NMR của 1 xuất hiện tín hiệu của 15 cacbon đều thuộc vùng cộng hƣởng của các vòng thơm, bằng các phổ DEPT xác định đƣợc 1 có 6 cacbon bậc 3 (CH) và 9 cacbon bậc 4 (C). Các giá trị C 158,19 và 104,49 điển hình cho C-9 và C-10 trên vòng A của các hợp chất flavonoid có nối đôi tại C-2/C-3. Bên cạnh đó 2 giá trị độ chuyển dịch hóa học C 99,22 và 94,40 cho thấy vòng A còn có thêm 1 nhóm OH tại vị trí C-7.
81
Phổ cacbon của hợp chất 1
82
83
Phổ DEPT của hợp chất 1
84
85
Hình 30. Phổ DEPT của hợp chất 1
Phân tích các dữ kiện phổ thu đƣợc và so sánh với chất Quercetin trong tài liệu đã công bố [6]. Hợp chất 1 đƣợc xác định là Quercetin còn có tên gọi là 3,3',4',5,7-pentahydroxyflavone, một trong những hợp chất phổ biến đƣợc tìm thấy ở nhiều loài thực vật trong thiên nhiên.
86 Bảng 20. Dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất 1 C ]1[b,aC* Cd, e H d,f mult. (Jin Hz) 2 146.8 147.96 - 3 135.6 137.19 - 4 175.7 177.27 - 5 160.6 162.45 - 6 98.1 99.22 6.18 d (2.0) 7 163.8 165.51 - 8 93.3 94.40 6.38 d (2.0) 9 156.1 158.19 - 10 103.0 104.49 - 1′ 121.9 124.13 - 2 ′ 115.1 115.98 7.42 d (2.0) 3′ 145.0 146.17 - 4′ 147.6 148.72 - 5′ 115.5 116.20 6.88 d (8.5) 6′ 119.9 121.67 7.64 dd (2.0. 8.5)
aĐo trong dung môi DMSO;b
75 MHz;c300 MHz;.dĐo trong dung môi MeOD; e125 MHz.f500 MHz; * tín hiệu bị che khuất, *Ca,b quercetin[6].
87
Cấu trúc hóa học của hợp chất 1 đƣợc thể hiện trên hình 25 với công thức phân tử là C15H10O7 O O OH HO OH OH OH 2 4 5 7 9 1' 3' 5' 10
Hình 31. Cấu trúc hóa học của hợp chất 1. (Quercetin)
Nhƣ vậy, trong phân đoạn ethylacetat của cây Trâm lý, chúng tôi đã phân lập đƣợc hợp chất Quercetin. Theo rất nhiều tài liệu, Quercetin có tác dụng kích thích sửa chữa AND và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thƣ, chống oxy hóa mạnh, làm bền thành mạch máu…Quercetin cũng đƣợc chứng minh là có khả năng làm giảm cholesterol máu, giảm trọng lƣợng chuột béo phì thực nghiệm và làm giảm glucose huyết ở chuột đái tháo đƣờng type 2.
88
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Các phân đoạn dịch chiết đều có các hợp chất tự nhiên: flavonoid, tannin, glycoside, alkaloid, trong đó chủ yếu là flavonoid đã đƣợc phân tích bằng các phản ứng hóa học đặc trƣng và bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng trên tấm silicagel: phân đoạn cao cồn tổng số (7 băng), phân đoạn n hexan (2 băng), phân đoạn chloroform (6 băng), phân đoạn ethylacetat (3 băng).
2. Đã áp dụng thành công mô hình chuột béo phì và đái tháo đƣờng typ 2 thực nghiệm bằng thức ăn có hàm lƣợng Lipid cao và tiêm STZ liều đơn, trong đó trọng lƣợng chuột báo phì tăng gấp 1,7 lần so với lô chuột ăn thức ăn thƣờng, nồng độ glucose huyết của chuột đái tháo đƣờng typ 2 tăng gấp 1,61 lần so với chuột béo phì không tiêm STZ liều đơn.Sau khi điều trị bằng các dịch chiết của cây Trâm lý, nồng độ glucose huyết và các chỉ số mỡ máu của chuột béo phì, chuột đái tháo đƣờng typ 2 đều giảm, trong đó cao phân đoạn dịch chiết ethylacetat cho kết quả điều trị tốt nhất.
3.Đã xác định đƣợc cấu trúc hóa học của hợp chất tự nhiên trong dịch chiết phân đoạn ethylacetat là Quercetin.
89
KIẾN NGHỊ
1. Tinh chế hàm lƣợng lớn Quercetin có trong dịch chiết phân đoạn ethylacetat để nghiên cứu khả năng làm giảm trọng lƣợng cơ thê, một số chỉ số sinh hóa của chuột béo phì và chuột đái tháo đƣờng typ 2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết ethylacetat và chất tinh khiết Quercetin lên một số emzyme của chuột liên quan đến quá trình trao đổi lipid – glucid.
90
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt
1. Trƣơng Quốc Bảo, Hải Ngọc (1994), “tiêu khát”, Chữa bệnh nội khoa bằng Y học cổ truyền, tr. 211 – 215.
2. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập và Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc
ở Việt Nam tập I, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 1061 – 1063.
3. Tạ Văn Bình (2007), Những nguyên lý nền tảng– tăng glucose máu, NXB Y
học, Hà Nội.
4. Bộ môn Y học Cổ truyền dân tộc – Trƣờng Đại học Y Hà Nội (1999), “Đái tháo
đường”, Y học cổ truyền, NXB Y học, tr. 542 – 543.
5. Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Quốc Khang, Đào Kim Nhung (1997), thực tập sinh hoá, Đại học Tổng hợp Hà Nội.
6. Đỗ Hùng Cƣờng, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Đỗ Ngọc Liên (2009). “Tác dụng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất của dịch chiết quả dọc (Garcinia multiflora) trên chuột béo phì thực nghiệm”. Tạp chí Y học Việt Nam. 2009/số 2.
Trang 56 – 62.
7. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 136 – 140.
8. Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến, (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, NXB Y học, Hà Nội.
9. Trần Tử Dƣơng (2002), Rối loạn lipid máu, bài giảng sau đại học – Cục Quân Y, tr. 117 – 132.
91
10.Nguyễn Công Khẩn (2007). “Thừa cân, béo phì và một số yếu tố liên quan ở
người trưởng thành Việt Nam từ 25 – 64 tuổi”. Chiến lƣợc quốc gia về dinh dƣỡng
giai đoạn 2001 – 2010. NXB Y học Hà Nội.
11.Phan Quốc Kinh, Phạm Gia Khôi, Nguyễn Lân Dũng, (1989), Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học, NXB Khoa học và Kinh tế, Hà Nội.
12.Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Đỗ Văn Phúc, Vũ Công Phong, Phùng Thanh Hƣơng (2010). “Tác dụng dịch chiết cùi bưởi Citrus grandis (L.) Obeck đến
một số enzyme trao đổi lipid-saccarit và một số chỉ số lipid, glucose máu trên chuột béo phì và đái tháo đường thực nghiệm”. Tạp chí khoa học-Journal of
science.VNU. Tập 26, số 4. 2010.
13.Nguyễn Thị Thanh Ngân, Đỗ Ngọc Liên, Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Chử Lƣơng Luân, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Trần Văn Ơn (2010). “Xác định cấu trúc của
Quercetin 3-O-D-Glucopyranoside và Myricitrin tinh sạch từ phân đoạn dịch chiết lá khế (Averrhoa carambola L.) có tác dụng hạ glucose huyết trên chuột đái tháo đường thực nghiệm”. Tạp chí khoa học ĐHQG Hà Nội, Khoa học Tự nhiên và
công nghệ. Tập 26 (4). Trang 242 – 247.
14.Nguyễn Thị Thúy Quỳnh, Đỗ Ngọc Liên, Lê Minh Hà (2009). “Nghiên cứu một
số hợp chất từ phân đoạn dịch chiết cùi bưởi Năm roi (Citrus grandis L.) có tác dụng giảm thể trọng và mỡ máu trên chuột béo phì thực nghiệm”. Tạp chí hóa học
và ứng dụng. Số 18 (102). 2009. Trang 36 – 40. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
15.Đỗ Trung Quân (2007), “Đái tháo đường và Điều trị”, NXB Y học.
16.Trần Đức Thọ (2002), “Bệnh đái tháo đường”, Bài giảng bệnh nội khoa, tập I, NXB Y học, tr.258 – 272.
92
17.Nguyễn Văn Thu (2004), “Bài giảng dược liệu tập 1”, NXB Y học, tr. 240, 335, 368.
18.Đỗ Thị Tính (2001), “Góp phần nghiên cứu các rối loạn Lipid trong máu bệnh
nhân béo phì trên các thông số hoá sinh”, Luận án Tiến Sỹ Y học – Hà Nội.
Tiếng Anh
1. Antolovich. M, Prenzler.P, Robards. K, Ryan. D. (2000), “Sample preparation
in the determination of phenolic compounds in fruits”, analyst, 215, pp. 989 – 1009.
2. Andersen M., Kenneth R.M., (2006), “Flavonoids Chemistry, Biochemistry and
Applications”, CRC Press, Taylor & Francis Group.
3. Barnett H H;and Kumar S.(2009), Obesity and diabetes,second edition,Wiley Blackwell,Printed in Great Britain.
4. Bhavana S., Satapathi S. K., Roy P. (2007), Hypoglycemic and Hypolipidemic effect of Aegle marmelos L. leaf extract on Streptozotocin induced diabetic mice. International Journal of Pharmacology 3 (6) 444 – 452.
5. Cannell R. J. P (1989), Natural Products Isolation, Humana Press, pp. 354. 6. Chien-Chang Shen, Yuan-Shiun Chang, and Li-Kang Ho, Nuclear magnetic resonance studies of 5,7-dihydroxyflavonoids, Phytochemistry, Vol. 34, No. 3, pp
843-845.
7. Dattajirao K., Iliya P. (1990), “Dietary Tannins”, pp 5 – 7.
8. Foster D.W. (1998), “Diabetes mellitus”, Harrison/s principles of internal medicine, McGrw – Hill, Vol. 2, pp. 1979 – 2000.
9. Greesman (1975), “The chemistry of flavonoid compounds” Academicporess,
93
10.Harbonne J. B. (1994), The flavonoids advance in research since 1986,
Chapman & Hall, pp. 1 – 676.
11.Haslam (1989), “Plant polyphenol-vegetable Tannins” Revisited Chemistry and Pharmacology of Natural products, Cambridge University Pres, Cambride, pp. 165. 12.Hayerman A. E., Bulter I. G. (1994), “Assay of condensed tannin or flavonoid oligomers and related flavonoid in plant” Meth, Enz, Vol. 234, pp. 249.
13.Henning Beck – Nielse and Ole Hother – Nielsen (1996), “obesity in non – insulin dependent diabetes mellitus”. Diabetes Mellitus, Lippincott – Raven, New
York, pp. 475 – 483.
14.Ji – Won Yoon (1996), “Role of viruses in the pathogenesis of insulin dependent diabetes mellitus”, Diabetes Mellitus, Lippincott – Raven, New York, pp. 339 –
347.
15.John H. Karam (1998), “Pancreatic Hormones and Antidiabetes drugs”. Basic and Clincal Pharmarcology, Appleton and Lange, pp. 684 – 705.
16.Karamali Khanbabaee and Teunis va Ree. (2001), “Tannins : Classfication and Definition”, Nat.Prod.Rep, 18, pp. 641– 649.
17.Lenzen S. (2008). “The mechanisms of alloxan and streptozocin-induced
diabetes”. Diabetologia 51:216-226. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
18.Lorke D. A. (1983), “A new approach to practical acute toxicity testing”, Arch Toxicol , Vol. 54, pp. 275 – 287.
19.Mohammed Rahmatullah, Mst. Afsana Khatun, Niaj MorshedDivision (1995), “A Randomized Survey of Medicinal Plants used by Folk Medicinal Healers of Sylhet”, Advances in Natural and Applied Sciences-American Eurasian Network for
94
20.Nilubon Jong-Anurakkun, Megh Raj Bhandari, Jun Kawabata, Alpha- Glucosidase inhibitors from Devil tree (Alstonia scholaris), Food Chemistry, 2006,
103, 1319-1323.
21.Payene R. L., Bidner T. D., Southern L. L., and Geaghan (2001), “Effect of
dietarysoy isoflavones on growth, carcass traits and meat quality in growing finishing figs”, J. Anim. Sci. 2001, 79, pp. 2130 – 2139.
22.Rajnikant, Dinesh and Kamni (2005), “Weak C – H …O hydrogen bonds in Alkaloids: An overview”, Bull. Master. Sci, vol. 28, No. 3, pp. 187 – 198.
23.Rence J. G., Tetsusok (2000), “Plant – fungal interaction the search for phytoalexin and other antifungal compounds from higher plants”. Phytochemistry,
Vol. 56, pp. 253 – 263.
24.Richard J. Comi (1996), “drug – induced diabetes”, Diabetes Mellitus,
Lippincott – Raven, New York, pp. 491 – 495.
25.Rodney Croteau, Toni M. Kuchan, Norman G. Lewis (2002), Natural products
(secondary metabolites), Chapter 24, pp. 2150 –1318.
26.Schinari R., Lin Y. M., Anderson H. (2007), “In vitro anti – HIV activity of flavonoids isolated from Rhus succedanea and Garcinia multiflora”, J Nat Prod,
Sep, 60(9), pp. 884 – 888.
27.Singleton V.L., Orthofer V.L., Lamuela-Raventos R.M., (1999), “Analysis of
total phenols and other oxydation substrates and antioxidants by means of Forlin- Ciocalteu Reagent”, Methods in Enzymemology, pp 152-178.
28.Srinivasan K., Viswanad., Asrat.L., Kaul C. L., Ramarao P. (2005), “Combination of hight – fat – diet – fet and low-does STZ treated rat: A model for
95
type 2 diabetes and pharmacological screening”. Pharmacological Reseach. 52
(2005), pp. 313 – 320.
29.Soumyanath A.(2006), Traditional medicines for modern times: anti-diabetic plants, CRP press.
30.Tan B. K. H., Tan C. H., Pushparaj N. P. (2005), “Anti-diabetic activity of the semi – purified fractions of Averrhoa bilimbi in high fat diet fed –streptozotocin- dinduced diabetic rats”, Life Sciences, Vol.76, pp. 2827 – 2839.
31.Trudy McKee; James R.McKee, Biochemistry, Second Edition, 1999, The Mc-