L ời cảm tạ
2.2.4 Ly trích DNA
Các giống đậu nành rau thơm và không thơm được trồng riêng biệt ngoài đồng, được phân biệt với nhau bằng cách cắm cọc treo nhãn tên của từng giống ở mỗi lô. Sau khi gieo được hai tuần, lấy lá non tiến hành ly trích DNA.
DNA được ly trích và giữ tinh sạch từ mô lá theo phương pháp CTAB như sau: - Cân mỗi mẫu lá khoảng 150 mg cho vào từng cốc riêng biệt.
- Cho thêm 1000 l dungdịch ly trích CTAB (đã làm nóng trong waterbath ở 650C trong 15 phút) và 10 l β-mercaptoethanol, nghiền mẫu thật mịn, hút hết phần dung dịch cho vào tube 1,5 ml.
- Lắc đều và ủ ở 650C trong 60 phút (tính từ lúc mẫu cuối cùng được nghiền xong). Cứ 10 phút lắc đều một lần.
- Ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút, lấy phần trong. - Thêm 500 l chloroform, lắc nhẹ 20 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần trong. - Thêm 5 l RNAse, trộn nhẹ và ủ trong waterbath ở 370
C trong 30 phút. - Thêm 500 l chloroform, lắc nhẹ trong 20 phút.
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần trong. - Thêm 400 l isopropanol, trộn đều ủ dưới nước đá 10 phút.
Phần trăm trái (lép, 1, 2, 3, 4 hạt) (%) = Số trái (lép, 1, 2, 3, 4 hạt) Tổng số trái chắc × 100 Trọng lượng 100 hạt (ẩm độ 12%) = P × (100 – A0 ) 88
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút, bỏ cẩn thận dung dịch trên và lấy cẩn thận phần tủa.
- Thêm 500 l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút.
- Lấy phần tủa để khô tự nhiên (khoảng 30 phút), cho vào 50 l TE buffer, lắc nhẹ (có thể ủ lạnh 650C trong 5 phút để DNA tan đều).
- Trữ lạnh ở -40C để đảm bảo chất lượng DNA.
DNA sau khi được ly trích và tinh sạch sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8%, sau đó được nhuộm bằng ethium bromide và chụp hình bằng máy chụp hình gel. Các mẫu có DNA tốt sẽ được sử dụng cho các phần ứng dụng tiếp theo.