III. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5.Quy trình nhân giống methanogen và bảo quản trong điều kiện kỵ khí
Chủng Methanosarcina sp. M37 được lựa chọn làm chủng gốc để tạo sinh khối lớn phục vụ cho mục đích bổ sung ban đầu vào các bể phân hủy kỵ khí ở điều kiện nước mặn.
Quy trình tạo sinh khối từ chủng M37 được trình bày ở hình 3.9 dưới đây.
/C ln ìn ạ M 3 7 g ố c \
V B a o quàn ờ 4°c J
ị l
Hình 3.9. Quy trình tạo nguồn methanogen từ chủng M37 để hỗ trợ các hệ thống xử lý kỵ khí hoạt động ở điều kiện nước lợ và nước mặn.
Quy trình được tiến hành theo các bước như sau:
B ư ớ c 1 . C h ủ n g g i ố n g M 3 7 đ ư ợ c b ả o q u ả n t r o n g m ô i trường d ị c h t h ể k ỵ k h í ở đ i ề u k i ệ n 4 ° c ( c ấ y t r u y ề n m ỗ i 8 - 1 0 t u ầ n v à o m ô i t r ư ờ n g t ư ơ i ) đ ư ợ c h o ạ t h ó a t r o n g c á c
b ì n h s e r u n d u n g t í c h n h ỏ v ớ i a c e t a t e ( 1 0 m M ) l à m c ơ c h ấ t . H a i l o ạ i m ô i t r ư ờ n g
khoáng (xem phần phương pháp) có hàm lượng NaCl khác nhau, tương ứng với nước lợ (15 g/L) và nước biển (26 g/L) được sử dụng để hoạt hóa cũng như nhân
g i ố n g c ấ p 1 v à n u ô i t ă n g s i n h đ ể c ó n g u ồ n m e t h a n o g e n h o ạ t đ ộ n g m ạ n h p h ù h ợ p
v ớ i m ỗ i i đ ề u k i ệ n m ô i t r ư ờ n g .
B u ' O ' c 2 . N h â n g i ố n g c ấ p 1 đ ư ợ c t h ự c h i ệ n t r o n g c á c b ì n h s e r u m thể t í c h 5 0 0 m l c h ứ a 4 0 0 m l m ô i t r ư ờ n g . C ơ c h ấ t s ử d ụ n g đ ể n h â n g i ố n g c ấ p 1 l à d ị c h l ê n m e n c á m
g ạ o 1 . 5 % t r o n g m ô i t r ư ờ n g k h o á n g n ư ớ c l ợ h o ặ c n ư ớ c b i ể n c ó b ổ s u n g n g u ồ n v i
s i n h t ừ d ị c h l à m g i à u v i s i n h v ậ t k ỵ k h í s ử d ụ n g r o n g b i ể n l à m c ơ c h ấ t . Q u á t r ì n h l ê n
m e n c ư ợ c t h ự c h i ệ n t r o n g t h ờ i g i a n 5 n g à y , s a u đ ó p H đ ư ợ c c h ỉ n h đ ế n 6 ( b ằ n g d u n g
dịch NaOH IM ) trước khi bổ sung vào bình nuôi nhân giống. Tỷ lệ dịch lên men
c á m g ạ o v à m ô i t r ư ờ n g t r o n g b ì n h n h â n g i ố n g l à 1 :1 ( v / v ) . T ỷ l ệ c ấ p g i ố n g đ ã h o ạ t
h ó a lồ 1 0 % .
Sự phát triển của m ethanogen trong bình nhân giống cấp I được đánh giá thông qua m ức độ và tính on định của việc sinh methane (Hình 3.10).
T h ờ i g i a n ( n g à y )
Hình 3.10. Sinh trưởng tạo methane của methanogen M37 trên môi trường khoáng và cám
g ạ o ( ] , 5 % ) l ê n m e n . T h í n g h i ệ m đ ư ợ c l ặ p l ạ i 2 l ầ n v à c á c g i á t r ị b i ể u d i ễ n t r ê n s ơ đ ồ l à g i á t r ị t r u n g b ì n h .
Có thể thấy thành phần m ethane trong khí sinh ra do chủng M 37 phát triển trên môi trường có cám lên m en làm cơ chất tăng mạnh ngay sau khi bắt đầu nuôi.
T ớ i n g à y t h ứ 8 t h à n h p h ầ n m e t h a n e t r o n g k h í s i n h r a đ ạ t ~ 3 2 % , n h ư n g s a u đ ó
khôn£ tăng nhiều ở những ngày tiếp theo (đạt ~ 33% ở ngày thứ 10). Không có sự
k h á c D iệt đ á n g k ể g i ữ a v i ệ c s i n h t r ư ở n g t r o n g m ô i t r ư ờ n g n ư ớ c l ợ v à n ư ớ c m ặ n d o
c h ủ n g M 3 7 c ó k h ả n ă n g s i n h t r ư ở n g ở p h ổ m u ố i r ộ n g . D o v ậ y , đ e t ạ o n g u ồ n
methcnogen từ chủng M3 7 chúng tôi lựa chọn môi trường nước biến nhân tạo với hàm Lrợng m uối là 26,4 g/L.
Bưó’c 3. Giống cấp I tạo ra ở b ư ớ c 2 đ ư ợ c sử d ụ n g để bổ s u n g vào các b ì n h nuôi tăng ánh. Bình Scott 2 lít (3 bình cho mỗi loại môi trường nước lợ hoặc nước biển) chứa 1,5 lít nước biển và cám gạo (1,5%) khử trùng 20 p h ú t ở 121°c, sau đó làm nguội và đuổi oxy trong bình bàng sục khí N2/C 02 (90:10, v:v) trong 5 phút rồi nhiễm 300 ml giống cấp I của chủng M37. Bình nuôi tăng sinh được đặt ở nhiệt độ
phòng, tránh ánh sáng. Để cân bằng áp suất khí trong bình, 1 - 2 chiếc kim được cắm vào nắp cao su của bình. Bước nuôi tăng sinh kéo dài 15 ngày và hàm lượng m ethane trong khí sinh ra được kiểm tra định kỳ.
B ưóc 4. Nguồn m ethanogen sau khi nuôi tăng sinh được kiểm tra dưới kính hiển vi huỳnh quang, xác định hoạt tính sinh m ethane và đưa vào bình chuyên dụng để bảo quản (Hình 3.1 ĩ).
Hình 3.11. Bình nuôi methanogen từ chủng M37 với cám gạo lên men trong môi trường nước biển sau ] 5 ngày (A) và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (vật kính 40x). Bình bảo quản nguôn methanogen ưa mặn BMS băng inox có van xả khí và chịu áp suât cao (C)
Hoạt tính sinh m ethane được xác định cho 1 ml dịch nuôi trong môi trường khoáng nước biển có bổ sung acetate (20 mM ) làm cơ chất và hoạt tính được tính theo lượng m ethane sinh ra trong 1 ngày. Theo đó, hoạt tính của m ethanogen trong bình nuôi tăng sinh đạt mức ~350 |im ol/m l/ngày, tương đương với bùn trong bể kỵ khí đang hoạt động tốt ở điều kiện nước ngọt (theo kết quả nghiên cứu phân tích m ẫu bùn của các hệ thống phân hủy kỵ khí).
Bên cạnh đó, sổ lượng m ethanogen trong m ẫu dịch nuôi được xác định bằng phương pháp M PN sử dụng môi trường dịch thể kỵ khí với N a-acetate làm nguồn cơ chất. Sinh trưởng của m ethanogen ừ ong các ống MPN được xác định thông qua sự có mặt của m ethane trong thành phần khí trong ống. Kết quả phân tích cho số lượng m ethanogen trong m ẫu dịch nuôi là 1,1 X 109 M PN/ml. Tuy nhiên, m ethanogen nuôi theo phương pháp này sẽ tồn tại phần lớn ở dạng hạt bùn, do vậy kết quả đếm MPN thường thấp hơn so với số lượng thực tế.
N guồn m ethanogen thu được ký hiệu là BMS sau đó được bảo quản trong bình kín có van m ột chiều để tránh tạo áp suất cao, đặt tại nhiệt độ phòng và tránh ánh sáng trực tiếp (Hình 3.11C). BM S có thể duy trì hoạt tính ổn định trong thời gian 12 tháng.