L I^ T EK VN { Roc het ềì GE Heolthcore B i^ med ỉc
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Làm giàu và phân lập methanogen
14. 16:00 16 :15 Phan Công Hoàng, Lê Bảo & Hoàng Tùng
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Làm giàu và phân lập methanogen
Mau trầm tích biển được thu thập tại Cát Bà và Nha Trang ờ độ sâu 20 - 30 cm dưới lớp bùn đáy bề mặt. Mẫu được lấy
vào các bình kỵ khí, bảo quản trong lạnh và đưa về phòng thí nghiệm. Môi trường khoáng (Rabus et al, 2006) để làm
giàu methanogen gồm 26,4 g NaCI (đối với môi trường nước lợ: 13,7 g NaCI); 11,4 g MgCl2.6H20; 1,47 g CaCl2.2H20; 0,66 g KOI; 0,09 g KBr; 0,25 g NH4CI; 0,2 g KH2PO4; nước cất 1 lit. Môi trường sau khi khử trùng 20 phút ờ 12 1°c được để nguội xuống 80°c, sục khí N2/CO2 (90:10, v/v) trong 5 phút, rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước máy. Các
chất bổ sung sau đó cho 1 lít môi trường gồm 30 ml đệm NạHCŨ3 1M; 1 ml hỗn hợp vitamin; 1 ml hỗn hợp vi lượng
các chất, dòng khí N2/CO2 vẫn được duy trì sục qua môi trường để loại oxy. pH của môi trường được chỉnh đến 7,2-7,4 bẳng các dung dịch Na2CŨ3 1 M hoặc HCI 1 M. Môi trường sau đó được san vào các bình serum thể tích 100 ml (50 ml/bình), đậy nút cao su và kẹp nhôm để nuôi methanogen.
Mô hình thử nghiêm
Các mô hình biogas được đặt trong binh Scott 2 lít chứa 1,8 lít nước biển tự nhiên (từ Nha Trang hoặc Cát Bà) với cơ chất duy nhất là rong xả lách hoặc phối trộn với một trong số các chất thải có hàm lượng hữu cơ cao là bùn đáy đầm tôm và chất thải từ trại nuôi lợn thịt theo tỷ lệ 20% mỗi loại (thể tích). Trong thí nghiệm sử dụng rong biển kết hợp với bùn đầm tôm và chât thải chăn nuôi, hai mô hình được thiết lập để so sánh, trong đó một mô hình có bồ sung Na- molybdat (1 mM) để ức chê sự phát triển của vi khuẩn khử sulfate (SRB) và một mô hinh không có. Nguồn vi sinh khởi động bổ sung vào các mô hình là dịch làm giàu methanogen từ trầm tích biển với Na-acetate là nguồn điện tử (theo tỷ lệ
10% thể tích).
Tồng lượng khi sinh ra trong các mô hình được xác định bằng phương pháp cột khí (Lettinga, 1995). Hàm lượng khí methane trong biogas được đo bằng phương pháp sắc ký khí trên thiết bị Agilent 7900A. Phân tích được thực hiện trên cột Agilent 19095p-Q04 với nhiệt độ cột và đầu đọc TCD là 250°c, nhiệt đô lò là 60°c, khí mang heli được bơm với tốc độ dòng 3 ml/phút theo chế độ tách dòng.
COD được xác định theo phương pháp quy chuẩn TCVN 6491:1999.
Hàm lượng muối trong nước biển được xác định bằng phương pháp cân trọng lượng. Lấy 20 ml mẫu vảo chén sứ đã biết trọng lượng, đun cách thuỷ tới khi cạn nước. Bổ sung 20 ml H2O2 20% vào chén sử, lắc đều và đun cách thuỷ để
oxy hoá các chát hữu cơ có trong mẫu nước biển cho đến khi cạn. Tiếp tục rửa mẫu bằng H2O2 20% từ 3 đến 5 lần. sấy
chén sứ ờ 105°c trong 2 h đến khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng mẫu khô và chén sứ để tính hàm lượng muối trong mẫu.
Điện di biến tính
DNA tổng số từ các mẫu hỗn hợp và chủng thuần khiết vi sinh vật được tinh sạch theo phương pháp của Zhou và cs.
miêu tả (Zhou et ai., 1996). Để phân tich cấu trúc quần thể methanogen trong các mẫu làm giàu, đoạn gen 16S rDNA
(350 bp) được khuếch đại PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu 348AÍ- TCCAGGCCCTACGGG và 691R-
GGATTACARGATTTCAC (Wanatabe et a i, 2004). Đe ổn định mức di chuyển của các sản phẩm PCR trên gel điện di
biên tính, kẹp GC (Wanatabe et al., 2004) được gắn vào đầu 5’ của đoạn mồi 0348aF. PCR được thực hiện với chế độ
nhiệt: 94°C/3', 40 chu kỳ của 94°c/1', 49°c/1' và 72°C/2’; 72°C/8'. sản phẩm PCR được điện di trên gel 1 % agarose, đệm TAE, 110 V, 15 phút.
Điện di biến tính (DGGE - Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) được thực hiện trên gel 8% polyacrylamide trong đệm 1xTAE với độ biến tính của gel (urea/formamide) từ 25 đến 60%, chế độ điện di là 200 V ở 60°c trong 3,5 giờ
(Wanatabe et al., 2004). Gel điện di được nhuộm với edithidium bromide (5 mg/ml) trong 15 phút, rửa bằng nước cất
trong 5 phút và quan sát dưới đèn uv trên máy soi gel GelDoc (Biorad, USA). Băng điện di sau đó được cắt và chuyển
vào 100 |il nước khử ion để thôi gel qua đêm tại 4°c. Dịch thôi gel sau đó được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen 16S rDNA sử dụng cặp mồi 348Af và 691R nhưng không gắn kẹp GC. Sản phẩm PCR tiếp theo được tinh sạch bằng PCR-purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự với mồi 348Af.
Hàm lượng muối trong nước biển được xác định bằng phương pháp cân trọng lượng. Lấy 20 ml mẫu vào chén sứ đã biết trọng lượng, đun cách thuỷ tới khi cạn nước. Bổ sung 20 ml H2O2 20% vào chén sứ, lắc đều và đun cách thuỷ để
oxy hoá các chat hữu cơ có trong mẫu nước biển cho đến khi cạn. Tiếp tục rửa mẫu bằng H2O2 20% từ 3 đến 5 lần. sấy
chén sứ ờ 105°c trong 2 h đến khi trọng lượng không đổi. Cân trọng lượng mẫu khô vả chén sứ để tính hàm lưựng muối trong mẫu.
KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Mô hình hệ thống phân hủy kỵ khí rong biển trong điều kiện nước mặn
Hỗn hợp cơ chất và điều kiện vận hành cùa các mộ hình đã thực hiện trong nghiên cửu được trình bày ở bảng 1. Nước
mặn sử dụng để bổ sung vào các mô hình được lấy từ hai địa điềm biển khác nhau và có hàm lượng muối cũng khác
nhau, cụ thể là nước biển Nha Trang có nồng độ muối 26 % 0 trong khi đó nước biển Cát Bà với nồng độ muối 17 %0.
Báng 1. Công thức thiết lập các mô hình lên men ky khí đã thực hiện trong nghiên cứu
STT Tên mô
hình Thành phần hữu CO’ phôi trộn
Điều kiện vận hành
(nồng độ muối, %o)
Hàm lượng COD hòa tan (mg/L)
1 MH1 Rong xà lách ( Ulva sp.) 26 % 0 (nước biển Nha Trang) 7200
2 MH2 Rong xà lách (Ulva sp.)
Bùn đầm tôm
17 % 0 (nước biển Cát Bà) 9760
3 MH3A Rong xà lách ( Ulva sp.)
Bùn đầm tôm Chất thải chăn nuôi
17 % 0 (nước biển Cát Bà) 12560
Bùn đâm tôm Chất thải chăn nuôi Na-molybdat (1 mM)
Như vậy, bằng cách bổ sung thêm các nguồn thài giàu hữu cơ khác vào mô hình cùng với rong biển như bùn đầm tôm hay chất thải từ trang trại nuôi lợn thịt, COD hòa tan trong các mô hình có thể tăng lên đáng kể, giữa MH1 và MH3A, MH3B hơn kem nhau 74,4%.
Đẻ rút ngắn thời gian khởi động của mô hình, dịch làm giàu methanogen từ trầm tích biển với cơ chất Na-acetate được bổ sung váo các bình lên men theo tỷ lệ 10 % thể tích. Quá trinh phân hủy được đánh giá thông qua mức giảm COD hòa tan và tăng tỷ lệ methane trong khí biogas sinh ra trong các bình thí nghiệm (hinh 1).
M H l M H 2 M H 3 A M H 3B M H 1 M H 2 M H 3 A M H JB
Mô hình thí nghiệm Mô hình thí nghiệm
Hinhi 1. Chuyển hóa COD (A) và tạo methane (B) trong các mõ hình thí nghiệm lên men kỵ khí rong biển
Có thể thấy 'ằnig quá trinh phân hủy kỵ khí trong các mô hình 2, 3A và 3B đã diễn ra tích cực (hinh 1A). Đặc biệt ở mô hình 3B, 64,4 % COD đã bị loại sau 60 ngày (từ 12560 mg/L còn 4480 mg/L) và 98% COD đã bị loại tiếp tục (còn 240 mg/L) sau 90 ri'gay. Trong khi đó ở mô hình 1 với điều kiện vận hành là nước biển có hàm lượng muối cao hơn (26 %o) thi quá trinh phân hủy hâu như không diễn ra, hàm lượng COD hòa tan vẫn không thay đổi sau 90 ngày. Tuy nhiên, ngoài ảnh hưởng của nồng độ muối thì sự khác biệt về thành phần chất hữu cơ trong mô hinh 1 cũng co thể là nguyên nhân dẫn đến tốc độ phân hủy chậm trong mô hình này.
Kết quá Xấc đinh tỷ lệ methane sinh ra trong các mô hình cũng thống nhất với Kết quả phân tích COD (hình 1B). ớ thời
điểm 60 ngả/, khí methane chiếm 25,5% tổng lượng khí sinh ra trong MH2 và tới gần 40% trong các mô hình 3A và 3B. ở thời điểm 90 ngày, trong khi tỷ lệ methane ờ MH2 và MH3A chỉ tăng tới mức ~50% thi ờ MH3B tỷ lệ methane lên tới 81,8%, là mót tỷ lệ rất cao, thậm chí đối với cả các hệ thống lên men kỵ khí hoạt động ở điều kiện nước ngọt (Nasir et
3/., 2012).
Mặc dù vậy, th'ời gian phân hủy kỵ khí ở điều kiện nước mặn trong các mô hình thí nghiệm dải hơn đáng kể so với ờ điều kiện nuớc: ngọt (thường loại được tới 90% COD trong 30 ngày, Lettinga, 1995). Bên cạnh đó, sự có mặt của các nguồn thải hữui cơ dễ phân hủy như bùn đầm tôm, hay đặc biệt là chất thải chăn nuôi là một yếu tố làm tăng hiệu suất cũng như tố; đtộ phân hủy. Hàm lượng muối cao (như MH1, 26 %o) ức chế quá trình phân hủy. Ngoài ra, việc bổ sung Na-molybda:e ((1 mM) vào MH3B không những làm tăng mức chuyển hóa sinh methane (do SRB bị ức chế) mà còn tăng cả hiệu suất loai COD nói chung.
Phân tích thành phần methanogen trong các mô hình
Thành phần miethanogen trong các bình mô hình phân hủy kỵ khí và dịch làm giàu ở điều kiện nước biển được phân tích bằng phương pháp điện di biến tinh (DGGE) gen 16S rDNA (hình 2)._CÓ thể thấy rằng các loài methanogen thuộc chi Methancsaircina tạo nên các băng chính trên gel điện di DGGE, chứng tò chúng là đại diện của nhóm methanogen chiếm ưu thè trong các mô hình thí nghiệm. Các nghiên cứu về đa dạng methanogen trong các bề phân hủy kỵ khí cũng
cho thây Methanosarcina lả nhóm chiếm số đông, bên cạnh đó Methanolobus spp., Methanothrix spp. hay
Methanosaeta spp. cũng đóng vai trò quan trọng (Klockea et a i, 2008). Theo tính toán cân bằng chất, methane tạo ra từ
acetate do rhóim methanogen sử dụng acetate như Methanocarcina đóng góp tới trên 70% của tổng lượng methane có