2.1. Nguyên liệu
- M ầu trầm tích biển được thu thập tại vùng biển N ha Trang và Cát Bà ở độ
s â u 2 0 - 3 0 c m , đ ư a v à o c á c d ụ n g c ụ c h ứ a k ỵ k h í , b ả o q u ả n t r o n g n ư ớ c đ á c h o đ ế n
k h i v ề p h ò n g t h í n g h i ệ m đ ể l à m g i à u v à p h â n l ậ p v i s i n h v ậ t .
- Bùn đầm tôm được thu tại công ty nuôi tôm M inh Thành (Quảng Ninh) vào thời điểm sau khi thu hoạch lứa tôm nuôi và dọn đầm.
- Rong biển: rong xà lách (Uỉva sp.), rong mơ (Sagrasum sp.) được thu ở ven biển Nha Trang, K hánh Hòa, đưa về phòng thí nghiệm và cấp đông. Khi sử dụng làm cơ chất trong các mô hình lên men kỵ khí, rong được rã đông, rửa sạch và cắt nhỏ ( 3 - 5 mm).
2.2. P h ư ơ n g p h á p
2.2.1. C ác p h ư o n g p h á p vi sinh v ậ t học
Làm giàu và phân lập methanogen
Môi trường khoáng cơ bản (W iddel, Bak, 1992) để làm giàu và phân lập m ethanogen gồm 26,4 g NaCl (đối với môi trường nước lợ: 13,7 g NaCl); 11,4 g M gCl2.6H20 ; 1,47 g CaC l2.2H20 ; 0,66 g KC1; 0,09 g KBr; 0,25 g N H4C1; 0,2 g KH2P 0 4; trong 1 lít nước cất.
Môi trường sau khi khử trùng 20 phút ở 121°c được để nguội xuống 80°c, sục khí N2/C O2 (90:10, v/v) trong 5 phút, rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng bằng nước máy. Các chất bổ sung sau đó cho 1 lít môi trường gồm 30 ml 1 M N aH C 0 3; 1 ml hồn hợp vitam in; 1 ml hỗn hợp vi lượng (W iddel, Bak, 1992); 1 ml 1 M N a2S; 10 ml l M cơ chất (N a-acetate hoặc methanol). Trong khi bổ sung các chất, dòng khí N2/C O2 vẫn được duy trì sục qua môi trường để loại oxy. pH của môi trường được chỉnh đến 7,2-7,4 bằng các dung dịch 1 M N a2C 03 hoặc 1 M HC1. Môi trường sau đó được san vào các bình serum thể tích 100 ml, đóng kín bằng nắp cao su và sử dụng để nuôi m ethanogen.
Trong thí nghiệm làm giàu, mẫu trầm tích biển được đưa vào các bình serum (theo tỷ lệ 10% thể tích môi trường, w/v) chứa môi trường khoáng kỵ khí và một cơ chất N a-acetate hoặc methanol, nuôi ở 3 0 °c. Sinh trưởng của m ethanogen trong các bình nuôi cấy được đánh giá thông qua thể tích khí tạo thành sau mỗi 7 ngày (đo thể tích cột nước) và quan sát m ật độ tế bào dưới kính hiển vi huỳnh quang (nhờ tính tự phát sáng của coenzym e F420 ở methanogen). Sau 4 tuần, dịch nuôi được cấy truyền
sang môi trường tươi. Quá trình làm giàu được thực hiện qua 3 lần cấy truyền, m ẫu ở lần cuối cùng được sử dụng để phân lập chủng methanogen thuần khiết.
M ethanogen được phân lập trong dãy ống thạch bán lỏng chứa môi trường khoáng cơ bản như trên bổ sung 10 g/1 thạch và cơ chất tương ứng với mẫu làm giàu (Widdel, Bak, 1992). Khuẩn lạc methanogen được tách bằng đầu pipet Pasteur kéo dài và chuyển sang môi trường kỵ khí dịch thể. Quá trình tinh sạch trên môi trường thạch bán lỏng được lặp lại với mỗi chủng phân lập từ 2-3 lần.
Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Tế bào ở pha sinh trưởng của methanogen được đưa lên phiến kính phủ thạch và chụp ảnh trên kính hiển vi phản pha ở độ phóng đại lOOx. Để quan sát khả năng tự phát sáng của tế bào (nhờ coenzyme F420), tế bào được đưa lên màng nitrocellulose (M illipore) và quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang với kính lọc cho bước sóng trong khoảng 358 - 461 nm (Dolfing, M ulder, 1985).
Nghiên cứu đặc điểm sinh lý
Các thí nghiệm nghiên cứu đặc tính sinh học được thực hiện trong các bình serum hoặc ống nghiệm có nút cao su chứa môi trường dịch thể kỵ khí với các thành phần m uối hay cơ chất được bổ sung như sau:
- Nồng dộ m uối NaCl: 1; 5; 10; 17; 20; 26; 33; 40; 50; 60 g-L~' bằng cách bổ sung dung dịch m uối 5 M (NaCl 286,4 g; M gC l2-6H20 44,7 g; CaCl2-2H20 2,2 g, nước cất dẫn tới 1000 ml) vào các bình hoặc ống nghiệm nuôi m ethanogen để được nồng độ mong muốn.
- pH 5,0; 5,5; 6,5; 7,0; 7,5 và 8,5 bàng cách bổ sung các dung dịch N a2C 03 1 M hoặc HC1 1 M vào các bình hoặc ống nghiệm nuôi m ethanogen để được pH mong muốn.
- Cơ chất khác nhau gồm hydro, acetate, m ethanol và trim ethylam ine được bổ sung vào m ôi trường ở nồng độ 10 mM mỗi loại.
- Các điều kiện nhiệt độ thử nghiệm gồm có: 2 0 °c, 2 5 °c, 3 0 °c , 37°c và 4 5 °c Khả năng sinh trưởng của methanogen ở các điều kiện khác nhau trong thí nghiệm này được đánh giá dựa trên mức sinh trưởng (chỉ số ODõoo của dịch nuôi) và hàm lượng C H4 theo thời gian qua phân tích trên thiết bị sắc ký khí A gilent 7890A.
17
ị í ' Ạ ỉ H O C Q U u C G IA Ha n o i I I TRUNG TẦM T H Ô N G TÍN THƯ V IỆ N ị
- Bảo quản tại 4°C: các c h ủ n g methanogen được nuôi trong môi t r ư ờ n g kỵ khí dịch thể thích hợp trong các ống nghiệm nút xoáy. Khi các chủng sinh trưởng đạt mật độ tế bào cao (sau 5 - 7 ngày), chuyển các ống nghiệm này bảo quản tại 4 ° c . Cứ sau 12 tuần, các chủng này được cấy truyền sang ống m ôi trường kỵ khí dịch thể mới.
- Bảo quản tại -20°C : methanogen được nuôi trong môi trường khoáng kỵ khí thích hợp trong thời gian 5 - 7 ngày trong các ống nghiệm nhỏ có nút cao su và nắp xoáy bằng nhựa. Sau đó dịch nuôi được ly tâm (sử dụng ngay ống nuôi để tránh tiếp xúc của tể bào với không khí) ở 4000 - 5000 vòng/phút trong thời gian từ 10 - 20 phút. Te bào sau đó được tạo huyền phù trong môi trường khoáng kỵ khí tươi và bổ sung chất chống đông (nồng độ cuối cùng DMSO 5%) rồi đưa vào điều kiện bảo quản lạnh sâu -2 0 . Sau 10 ngày, lấy 1 ống giống ra kiểm tra bằng cách cấy truyền sang môi trường dịch thể thích hợp.
Thiết lập m ô hình b ể biogas với các nguồn cơ chất khác nhau
M ô hình lên men kỵ khí được thiết lập trong bình Scott 2 lít chứa 800 ml môi trường khoáng nước lợ hoặc nước biển và rong biển (Ulva sp.) làm nguồn hữu cơ. N guồn vi sinh vật sinh m ethane là dịch nuôi bùn trầm tích từ Cát B à với Na-acetate làm chất cho điện tử. Bình được đậy kín bàng nút cao su, có nối với bộ phận đo lượng khí sinh ra theo phương pháp cột nước và đường lấy mẫu để phân tích (hình 1A). M ầu khí được lấy trực tiếp bằng xilanh có khóa (Agilent) qua nắp cao su và đưa lên máy sắc ký để xác định hàm lượng CH 4.
2.2.2. C ác p h ư ơ n g pháp sinh học phân tử
Tách DNA tổng số và nhãn đoạn gen 16S rDNA
DNA tổng số từ các mẫu làm giàu methanogen được tách chiết theo phương pháp do Zhou et al. (1996) mô tả. Để phân tích cấu trúc quần thể m ethanogen trong các mẫu làm giàu, đoạn gen 16S rDNA (350 bp) được khuếch đại PC R sử dụng cặp mồi đặc hiệu 348Af- TCCA G G CCCTA CG G G và 6 9 1R-GGATTACARGATTTCAC (W anatabe et al., 2004). Để ổn định mức di chuyển của các sản phẩm PCR trên gel điện di biến tính, kẹp GC (M uezer et a l, 1993) được gắn vào đầu 5’ của đoạn mồi 0348aF. PCR được thực hiện với chế độ nhiệt: 94°C/3', 40 chu kỳ của 9 4 ° c /l', 4 9 ° c /l' và 72°C/2'; 72°C/8'. Sản phẩm PCR được điện di trên gel 1% agarose, đệm TAE, 110 V, 15 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Điện di biến tính (DGGE - Denaturing G radient Gel Electrophoresis) được thực hiện trên gel 8% polyacrylamide trong đệm lx T A E với độ biến tính của gel (urea/formamide) từ 25 đến 60%, chế độ điện di là 200 V ở 6Ơ°C trong 3,5 giờ. Gel điện di được nhuộm với edithidium brom ide (5 mg/ml) trong 15 phút, rửa bằng nước cất trong 5 phút và quan sát dưới đèn u v trên máy soi gel G elDoc (Biorad, USA).
Cắt băng, thôi g e ỉ và g iả i trình tự
Băng điện di được cắt và thôi trong nước cất vô trùng ở 4 ° c qua đêm. Dịch thôi gel sau đó được sử dụng làm khuôn để khuyểch đại đoạn gen 350 bp với cặp mồi 348F và 6 9 1R (không có kẹp GC). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng PCR purìication Kit (Bioneer, Hàn Quốc) và giải trình tự với mồi 348F.
Phân tích trình tự 16 S rDNA của các chủng methanogen thuần khiết
Các chủng m ethanogen thuần khiết được nuôi trên môi trường dịch thể, sau đó ly tâm thu sinh khối để tách DNA tổng số theo phương pháp của M arm ur (1961). Đoạn gen 16S rD N A của các chủng này được khuyếch đại với cặp mồi đặc hiệu A 109 f-ACKGCT c A G T AAC ACGT và A934b-G TG CTCCCCCG CCA A TTCCT (Groskopí' et al., 1998). Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng K it (Bioneer, Hàn Quốc), và sử dụng làm khuôn trong phản ứng đọc trình tự với ABI Prism BigDye Term inator cycle sequencing kit và đọc trình tự trên máy tự động 3110 Avant A ppied Biosystem s. Trình tự gen được phân tích, so sánh với trình tự 16S rDNA của các loài có liên quan trên GenBank sử dụng Blast Search. Cây phân loại được dựng theo phương pháp neighbour-joining (Saitou, Nei, 1987), trong đó định dạng cây được tiến hành dựa trên 1000 phép so sánh đa chiều (Felsenstein, 1985).
2.2.3. C ác p h ư o n g p h áp phân tích hóa học
COD (Chem ical Oxygen Dem and): được xác định theo TC V N 6491:1999.
Phân tích tổng lư ợ n g k h í sinh ra
Tổng lượng khí sinh ra được xác định theo phương pháp cột nước (Hình 2.1).
Đ i ệ n d i b i ế n t í n h
Hình 2.1. Nguyên lý của phương pháp cột nước xác định lượng khí sinh ra từ bể lên men kỵ khí (Lettinga, 1995).
Phân tích hàm lượng m ethane trong biogas
Thành phân khí m ethane trong các mẫu nuôi hay bể mô hình được xác định bằng sắc ký khí trên thiết bị A gilent 7890A sử dụng khí mang heli và đầu dò cảm ứng nhiệt TCD.
Xác định hoạt tính của methanogen trong bùn nuôi
1 ml m ẫu từ các bình nuôi methanogen được chuyển vào bình serum chứa môi trường khoáng kỵ khí với N a-acetate (20 mM) làm chất cho điện tử. Lượng m ethane sinh ra trong bình nuôi được xác định mỗi giờ m ột lần và hoạt tính của m ethanogen được tính theo lượng methane sinh ra (mmol) do 1 ml bùn trong 1 giờ.