III. KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. Quần xã methanogen trong các mẫu làm giàu
Các m ẫu làm giàu m ethanogen với cả hai loại cơ chất và môi trường nước lợ hoặc nước m ặn sau 3 lần cấy truyền đều thể hiện khả năng sinh khí cao và mật độ tế bào ôn định. Đe đánh giá được hiệu quả của thí nghiệm làm giàu, đồng thời xác định các nhóm m ethanogen thích ứng cao nhất với điều kiện làm giàu, quần xã m ethanogen trong các m ẫu làm giàu lần thứ 1 và 3 đã được phân tích thông qua phương pháp DGGE đối với đoạn gen 16S rDNA (~ 350 bp) khuếch đại từ DNA tổng số của các mẫu làm giàu với cặp mồi đặc hiệu cho nhóm cổ khuẩn là 0348aF- GC và 0 6 9 1R (Hình 3.4).
H ì n h 3 . 4 . P h â n t í c h q u ầ n x ã m e t h a n o g e n t r o n g c á c m ẫ u l à m g i à u v ớ i t r ầ m t í c h t ừ b i ể n N h a
Trang và Cát Bà bằng phương pháp PCR-DGGE gen 16S rDNA. A - Các mẫu làm giàu lần 1 (.1); B - Các mẫu làm giàu lần 3 (.3); Tên mẫu: 2 - Nha Trang/nước lợ/methanol; 3 - Nha Trang/nước mặn/acetate; 4 - Nha Trang/nước mặn/methanol; 5 - Cát Bà/nước
lợ/acetate; 6 - Cát Bà/nước lợ/methanol; 8 - Cát Bà/nước mặn/methanol
N hư vậy qua 3 bước làm giàu, các quần xã m ethanogen đã được thiết lập và có mức đa dạng tương đối cao. Có thể thấy quá trình làm giàu đã tạo điều kiện cho m ột số nhóm m ethanogen có tính thích nghi cao nhất được duy trì và tích lũy trở thành nhóm chiếm đa số trong quần xã (các băng điện di b l và b2). Không có sự khác biệt rồ ràng giữa các m ẫu làm giàu từ trầm tích biến N ha Trang (2, 3, 4) và Cát Bà (5, 6, 8) hay giữa điều kiện nước lợ (2, 5, 6) và nước m ặn (3, 4, 8).
/ 2 .1 3.1 4.1 5.1 6.1 8.1J'ĩ ’ ■ ĩ 8^5 - J'ĩ ’ ■ ĩ 8^5 - V f ' - « —• ^ - ! , ! ' ■-* r ' * 1 V - »■* ị !'■ Ị ‘ l í <«b2 »■■«*’■ •' ♦ V ; \ : 25
Mối liên quan khá rõ có thể thấy được giữa điều kiện làm giàu và quần xã m ethanogen thu được là mối liên hệ giữa nguồn cơ chất làm giàu và nhóm chiếm ưu thể. Cụ thể, với cơ chất m ethanol (mẫu 2, 6, 8) nhóm đại diện băng b l chiếm ưu thế, trong khi đó với cơ chất acetate (mẫu 3, 5) thì nhóm đại diện băng b2 chiếm ưu thế. Các nhóm này đã có m ặt trong m ẫu làm giàu lần 1 nhưng với số lượng thấp (băng điện di mờ) và được tăng thêm về số lượng sau 3 bước làm giàu (băng điện di đậm nét). Trường hợp ngoại lệ là m ẫu 4, tại thời điểm ban đầu có băng b l (đường gel số 4.1, hình 3.4A) nhưng sau quá trình làm giàu với nguồn cơ chất là methanol băng này biến mất, thay vào đó là băng b2 xuất hiện. Hai băng b l và b2 được cắt, thôi gel và giải trình tự. K ết quả so sánh với GenBank cho thấy băng b l và b2 tương ứng đại diện cho các loài Methanolobus sp. và Methanosarcina sp.
So sánh với các băng chính trên gel điện di DGGE của quần xã methanogen làm giàu, có thể thấy chủng M21 có nguồn gốc từ nhóm methanogen tương ứng với băng điện di b2 (Methanosarcina spp), trong khi đó chủng 23a xuất phát từ nhóm m ethanogen tương ứng với băng điện di b l (Methanolobus spp.) (H ình 3.5).
- M e t h n n o c o c c u s m a r i p a l u d ừ ( U 3 8 4 8 6 ) 771 1000 54 8361 896 M e t l i a n o s a i r i ì i a n i a z e i ( J Q 3 4 6 7 5 7 ) M e l h a n o s a i r ú i a s i c i l i n e ( F R 7 3 3 6 9 8 ) ~ 2 5 a ( K C 5 7 1 1 9 4 ) M e th a n o s a r c iì i a v a c u o l a t a ( F R 7 3 3 6 6 1) I - B 2 _ " L u ( K C 5 7 1 1 9 5 ) —.M e t h a n o s n r c in n s e m e s ia e ( N R 0 2 8 1 8 2 ) --- Aí e t l u m o l o b u s z i n d e r i ( N R 0 4 4 5 5 8 ) M e t h a n o l o b u s o r e g o ì ie n s i s ( U 2 0 1 5 2 ) --- BI 1000 878 962 - 2 3 a ( K C 5 7 1 1 9 3 ) M e t l i a i i o ì o b u s p r o f u n d i i ( N R 0 4 1 6 6 5 )
H ìn h 3.5. Cây p h â n loại n e i b o u r g h joining dựa trên trình tự đoạn gen 16S rDNA của các
c h ủ n g m e t h a n o g e n đ ạ i d i ệ n ( 2 1 , 2 3 a , 2 5 a ) v à c á c b ă n g đ i ệ n d i b i ê n t í n h ( b l , b 2 ) s o s á n h
vói các loài gần gũi thuộc hai chi M e th a n o s a r c in a và Methanococcus. Đơn vị = 0,02Knuc t r o n g t r ì n h t ự n u c l e o t i d e . C á c s ố h i ể n t h ị ở c á c v ị t r í p h â n n h á n h l à k ế t q u ả p h â n t í c h b o o t s t r a p đ ố i v ớ i 1 0 0 0 p h é p s o s á n h ( c h ỉ c ó c á c g i á t r ị t r ê n 5 0 0 đ ư ợ c t r ì n h b à y t r ê n h ì n h ) .
M e th a n o c o c c u s m a r ip a lu d is đ ư ợ c c h ọ n l à m o u t g r o u p .
Methanosarcina và Methanolobus là h a i c h i c ù n g n ằ m t r o n g họ
M e t h a n o s a r c in a c e a e . T r o n g k h i c h i M e t h a n o s a r c in a c h ủ y ế u g ồ m c á c l o à i
e t a l. , 2 0 0 0 ) , thì các l o à i M e t h a n o ỉo b u s đ ư ợ c p h â n l ậ p đ ề u t h u ộ c n h ó m s ử d ụ n g c á c h ợ p c h ấ t c ó n h ó m m e t h y l ( n h ư m e t h a n o l h a y m e t h y l a m i n e ) l à m c ơ c h ấ t đ ể s i n h
methane (4CH3OH —» 3C H4 + CO2 + 2H20 ) (M ochimaru et al., 2009; D oerfert et a l. , 2 0 0 9 ) , t h ậ m c h í n h i ề u l o à i h o à n t o à n k h ô n g c ó k h ả n ă n g s i n h m e t h a n e t ừ
H2/C 02 hay acetate (M ochim aru et al., 2009). N hư vậy trong nghiên cứu này các chủng methanogen phân lập được đại diện cho hai nhóm có đặc điểm sinh lý
c h u y ê n b i ệ t l à M e t h a n o s a r c in a v à M e t h a n o lo b u s , h ì n h t h à n h q u a q u á t r ì n h l à m g i à u
từ các mẫu trầm tích biển với hai nguồn cơ chất acetate và methanol.
3.4. L ựa chọn ch ủ n g th ích h ọp để ph át triển chế phẩm3.4.1. Lựa chọn chủ n g có hoạt tính cao