Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA)
- Cho 50 µl đệm PBS vào các giếng từ B1 đến H11 và cột 12 của phiến 96 giếng (cột 12 dùng để làm chứng hồng cầu)
- Cho 100 µl mỗi mẫu vào một giếng từ A1 đến A11. Pha loãng bậc 2 dịch nuôi cấy virút bằng cách chuyển 50 µl từ hàng A sang hàng B, thực hiện tương tự đến hàng H, loại bỏ 50 µl ở hàng H.
35
- Cho 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào mỗi giếng của phiến 96 giếng. Lắc nhẹ phiến, để 30 phút ở nhiệt độ phòng.
- Nhận định kết quả: chứng hồng cầu sẽ lắng xuống tạo thành một giọt tròn ở cột 12. Mẫu âm tính là mẫu có các giếng hồng cầu lắng hoàn toàn. Mẫu dương tính là mẫu có hiện tương ngưng kết hồng cầu hoàn toàn; hiệu giá virút được xác định là ở độ pha loãng cuối cùng của virút mà tại đó gây ngưng kết hồng cầu.
Kĩ thuật plaque [50]
+ Chuẩn bị phiến tế bào 24 giếng:
- Chuẩn bị tế bào MDCK trong môi trường phát triển với nồng độ: 5 x 105 tế bào / ml. - Nhỏ 0,5 ml hỗn dịch tế bào trên vào mỗi giếng của phiến 6 giếng. Ủ tế bào ở 370C, 5% CO2 - Theo dõi tế bào trong 24 giờ để có phiến tế bào với độ phủ kín 90% - 100 %.
+ Pha loãng virút:
- Pha loãng virút trong dung dịch PBS hoặc môi trường DMEM: pha loãng bậc 10, bắt đầu từ độ pha loãng 10-1
.
+ Gây nhiễm virút vào tế bào (phiến 6 giếng):
- Rửa tế bào bằng PBS rồi thêm 100 µl môi trường phân lập virút.
- Nhỏ 100 µl virút ở mỗi nồng độ pha loãng vào mỗi giếng tế bào. Ủ tế bào ở 370C, 5% CO2 trong 1 giờ.Trong thời gian ủ, chuẩn bị môi trường – thạch agarose.
+ Chuẩn bị môi trường – thạch agarose:
- Chuẩn bị môi trường phân lập virút đặc 2 lần.
- Chuẩn bị dung dịch agarose 2%, rồi giữ ấm ở nhiệt độ 650C.
- Trước khi sử dụng, trộn môi trường phân lập virút đặc 2 lần với dung dịch agarose 2% để tạo thành hỗn hợp đồng nhất.
36
- Dùng pi-pet nhỏ 1ml môi trường này vào mỗi giếng tế bào. Để nguội ở nhiệt độ phòng rồi ủ tế bào ở ở 370C, 5% CO2 trong 72 giờ.
+ Cố định, nhuộm tế bào:
- Loại bỏ môi trường – thạch agarose ở các giếng tế bào.
- Cố định tế bào bằng dung dịch formaldehyde 4% trong 30 phút. Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (2 lần)
- Nhuộm tế bào bằng dung dịch tím tinh thể 0,2% trong 5 phút
- Loại bỏ dung dịch cố định, rửa sạch phiến tế bào bằng nước, để khô tự nhiên.
+ Xác định hiệu giá virút:
- Xác định plaque: plaque có dạng tròn, không màu xuất hiện trong lớp tế bào bắt màu xanh. - Xác định số lượng plaque ở mỗi độ pha loãng
- Xác định giá trị PFU/ml: giá trị này được xác định tại độ pha loãng cuối cùng hình thành plaque. Ví dụ nếu ở độ pha loãng 10-6 là độ pha loãng cuối cùng tạo plaque thì hiệu giá virút sẽ được xác định tại độ pha loãng này. Ở độ pha loãng này nếu đếm được 9 plaque thì hiệu giá virút sẽ là 9 x 107 PFU / ml.