ADN đích là ADN được tổng hợp từ phân đoạn gen đích. Các phân đoạn gen đích trong nghiên cứu là HA, NA của virút A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) và PB2, PB1, PA, NP, M, NS của virút A/Hanoi/N062/2007 (H3N2). Chuẩn bị ADN đích là quá trình tổng hợp ADN đích từ tám phân đoạn gen đích nêu trên (full gene) bằng
42
PCR, xử lí ADN đích với enzyme ghới hạn BsmBI hoặc BsaI và xác định trình tự tám đoạn ADN đích.
a. Tổng hợp ADN đích bằng PCR
Hệ thống mồi cho PCR được thiết kế đáp ứng hai yêu cầu: tổng hợp ADN từ gen đích (full gene) và phù hợp cho việc đưa ADN đích vào plasmid đã xử lí với enzyme
BsmBI. Kết quả PCR của tám phân đoạn gen đích được thể hiện trong hình 3.4.
a. A/Hanoi/N062/2007 (H3N2)
b. A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)
Hình 3.4. Tổng hợp ADN đích bằng PCR
Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của tám phân đoạn gen đích trên gel agarose 0,8% (hình 3.4) đều xuất hiện các band có kích thước như dự tính khi thiết kế mồi. Sản phẩm PCR tuy có một hay nhiều band không mong muốn, nhưng đều có band mong muốn phân tách rõ ràng, hàm lượng cao hơn so với các band không mong muốn. Đây
43
là điều kiện thuận lợi để tiến hành tinh sạch sản phẩm chính và đảm bảo hiệu quả quá trình này.
Kết quả PCR thể hiện trong hình 3.4 chứng tỏ hệ thống mồi sử dụng trong nghiên cứu cũng như các quy trình nhiệt (trong PCR) đặc hiệu cho các phân đoạn gen của virút cúm, đáp ứng yêu cầu tổng hợp được các phân đoạn gen có chiều dài đủ.
Sản phẩm PCR mong muốn (ADN đích) được tinh sạch, loại bỏ các sản phẩm không mong muốn và các thành phần dư thừa của PCR, để đảm bảo hiệu quả quá trình nhân dòng. ADN đích sau tinh sạch được cắt bằng enzyme giới hạn và dùng làm khuôn cho quá trình giải trình tự.
b. Xử lí ADN đích bằng enzyme giới hạn
ADN đích được cắt bằng enzyme giới hạn BsmBI hoặc BsaI (tùy thuộc vào cặp mồi sử dụng cho PCR) để tạo đầu tận cùng tương đồng với đầu tận cùng plasmid. Sau quá trình cắt, tinh sạch sản phẩm bằng bộ sinh phẩm Wizard SV Gel & PCR Clean-Up System (PROMEGA) theo quy trình của nhà sản xuất. Kiểm tra sản phẩm PCR sau tinh sạch trên gel agarose 0,8% (hình 3.5).
a. A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) b. A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)
44
Kiểm tra quá trình tinh sạch ADN đích trên gel agarose cho thấy toàn bộ tám đoạn ADN đích đều là một band sáng duy nhất, có kích thước được xác định theo thang ADN chuẩn 1kb tương đương tám phân đoạn gen đã biết của virút cúm A. ADN đích sau tinh sạch được dùng để nhân dòng vào vector pHW2000.
c. Xác định trình tự các đoạn ADN đích (trƣớc nhân dòng)
Tám đoạn ADN đích được xác định trình tự nucleotide nhờ hệ thống mồi trong bảng 2.1 và 2.2 (trừ cặp mồi pHW-180F và pHW-100R). Trình tự các đoạn ADN đích trước nhân dòng được so sánh với trình tự ADN đích trong plasmid (sau nhân dòng), kết quả so sánh là cơ sở để lựa chọn plasmid cho hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm. Trình tự nucleotide của tám đoạn ADN đích được trình bày trong phụ lục 3 và được tóm tắt trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả giải trình tự các đoạn ADN đích trước nhân dòng.
Virút ADN đích Vùng giải trình tự (5’ – 3’) Chiều dài (nucleotide) A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) NS 16-875 860 M 16-1014 999 NP 16-1553 1538 PA 16-2206 2192 PB1 16-2329 2314 PB2 16-2325 2310 A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) HA 16-1765 1750 NA 16-1365 1350
45
Với mỗi đoạn ADN đích, kết quả giải trình tự thu được chuỗi nucleotide có chiều dài ngắn hơn từ 27 – 41 nucleotide tương đương với vị trí gắn mồi ở hai đầu tận cùng của ADN đích, cũng là vùng bảo tồn của virút cúm. Vùng được giải trình tự trên mỗi đoạn ADN đích đều tương ứng vùng mã hoá protein. Trình tự nucleotide của tám đoạn ADN đích đạt yêu cầu về chiều dài chuỗi, được sử dụng để xác định mức độ tương đồng của ADN đích trước và sau nhân dòng.