Với mỗi đoạn ADN đích nhân dòng, cần chọn một plasmid mang ADN đích để tạo thành hệ thống chuyển nhiễm tổng hợp virút cúm. Từ kết quả bảng 3.2, chúng tôi đã chọn đại diện ngẫu nhiên các plasmid sau:
Bảng 3.3. Tám plasmid lựa chọn cho hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm rg-A/H5N1
ADN đích Plasmid mang ADN đích (số thứ tự) Plasmid lựa chọn (số thứ tự) NS 1, 2, 3, 4 1 M 1, 2, 3, 4 1 NP 1, 2, 3, 4 1 PA 1, 2, 4, 5, 6 1 PB1 1, 2, 5, 6 1 PB2 3, 4, 5, 6 3 HA 1, 2, 3, 4 1 NA 1, 2, 3, 4 1
Mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm cần đảm bảo: mang đoạn ADN có trình tự tương đồng với trình tự ADN đích trước nhân dòng; thể hiện hoạt động trong tế bào chủ đó là khả năng tổng hợp sợi ARN và protein của virút tương ứng với đoạn ADN có trong plasmid. Tám plasmid đã chọn (bảng 3.3) sẽ được kiểm tra để đảm bảo hai điều kiện trên.
51
a. Xác định mức độ tƣơng đồng của ADN trong hệ thống chuyển nhiễm (sau nhân dòng) với ADN đích (trƣớc nhân dòng).
Các đoạn ADN trong hệ thống chuyển nhiễm (bảng 3.3) được giải trình tự nucleotide toàn phần nhờ hệ thống mồi bảng 2.2. Trình tự nucleotide của tám đoạn ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm được trình bày trong phụ lục 5. Trình tự nucleotide của ADN đích sau nhân dòng được so sánh với trình tự nucleotide của ADN đích trước nhân dòng. Kết quả so sánh trình tự ADN đích sau nhân dòng với ADN đích trước nhân dòng được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả so sánh trình tự ADN đích sau nhân dòng với trình tự ADN đích trước nhân dòng
Virút Phân đoạn
Chiều dài đoạn ADN đích Sự khác biệt Sau nhân dòng Trƣớc nhân dòng Vị trí Số nucleotide A/H3N2 NS 890 860 0 M 1027 999 132 1 NP 1565 1538 368 1 PA 2233 2192 723; 1285 2 PB1 2341 2314 159 1 PB2 2341 2310 295; 1887; 802 3 A/H5N1 HA 1778 1750 1749; 477 2 NA 1413 1350 842 1
52
So với ADN đích trước nhân dòng, trình tự nucleotide của ADN đích sau nhân dòng (trong hệ thống chuyển nhiễm) có sự thay đổi từ 1 đến 3 nucleotide tùy theo từng phân đoạn gen (bảng 3.3). Sự sai khác nucleotide có thể xảy ra do lỗi của enzyme tổng hợp AND [32] trong quá trình sao chép plasmid (trong tế bào vi khuẩn E.coli) hoặc khi thực hiện PCR của quá trình giải trình tự hoặc trong cả hai quá trình.
Các nucleotide sai khác trên ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm được xác định không nằm trong vùng không mã hóa ở đầu 5’ hoặc không ở vị trí của bộ ba khởi khởi đầu dịch mã. Vùng không mã hóa đầu 5’ trên ADN nhân dòng tương ứng với vùng không mã hóa đầu 3’ của sợi vRNA, có vai trò quan trọng đối với quá trình nhân lên của virút, là vị trí gắn của các polymerase virút để tổng hợp vRNA và mRNA. Thay đổi nucleotide xảy ra trong bộ ba khởi đầu dịch mã sẽ ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp protein. Như vậy, sự thay đổi nucleotide trên ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm tại các vị trí trình bày ở trên (bảng 3.4) đều không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp vRNA và protein virút, có thể cũng không làm thay đổi chức năng protein.
Một số thay đổi axit amin tại vị trí phân tách trên phân đoạn gen HA có thể dẫn đến thay đổi độc tính của virút cúm. Vị trí phân tách trên gen HA được xác định khoảng từ nucleotide thứ 967 đến 1142 [18, 54]. Kết quả so sánh trên cho thấy hai nucleotide sai khác ở vị trí 477 và 1749 trên gen HA không nằm trong khu vực phân tách, vì vậy cấu trúc phân đoạn gen HA của hệ thống chuyển nhiễm có thể vẫn biểu hiện đầy đủ đặc tính của protein HA chủng virút gốc A/Vietnam/1203/2004 (H5N1).
Kết quả phân tích khẳng định sự chính xác của các đoạn ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm so với các đoạn ADN đích, cho phép thực hiện các bước tiếp theo. Hệ thống chuyển nhiễm gồm tám plasmid (bảng 3.3) sẽ được kiểm tra hoạt động trước khi sử dụng để tổng hợp virút rg-A/H5N1.
53
b. Kiểm tra hoạt động của mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm.
Nhằm đảm bảo độ tinh sạch (tỉ lệ thành phần ADN đạt tối thiểu 70%) và nồng độ của mỗi plasmid (1 ug / 1 µl), trước khi thực hiện chuyển nhiễm các plasmid của hệ thống chuyển nhiễm trong nghiên cứu và hệ thống plasmid chứng dương được khuếch đại với thể tích lớn (100 – 200 ml) rồi tách plasmid. Sau quá trình khuếch đại, plasmid được xác định nồng độ và độ tinh sạch bằng máy nanodrop. Tất cả plasmid đều có nồng độ trên 1ug/µl và giá trị A260/280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0 (phụ lục 6), đảm bảo các yêu cầu về nồng độ và mức độ tinh sạch của plasmid [39, 49]. Kết quả này cho phép hệ thống chuyển nhiễm mà chúng tôi đã xây dựng (gồm 8 plasmid) được sử dụng cho các thí nghiệm chuyển nhiễm tạo virút.
Quá trình này được thực hiện trong Phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp độ III, Khoa An toàn sinh học và Quản lí chất lượng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Trong hệ thống chuyển nhiễm, mỗi plasmid riêng lẻ phải đảm bảo được hoạt động chức năng của mình cũng như khi phối hợp với các plasmid khác trong cùng hệ thống. Để xác định khả năng hoạt động của hệ thống chuyển nhiễm, chúng tôi tiến hành kiểm tra chức năng của từng plasmid đơn lẻ thông qua quá trình chuyển nhiễm vào tế bào 293T cùng với 7 plamsid còn lại của hệ thống plasmid chứng dương. Đánh giá chức năng của từng plasmid đơn lẻ trong hệ thống chuyển nhiễm này đó là sự hình thành virút cúm mới có mang một gen xác định của hệ thống chuyển nhiễm và 7 gen còn lại của virút cúm A/PR/8/34. Virút cúm mới phải đảm bảo được chức năng ngưng kết (HA) với tế bào hồng cầu gà, chuột lang, hoặc gà tây.
54
Bảng 3.5. Đánh giá chức năng mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm
Plasmid kiểm tra Virút đƣợc
tổng hợp Khả năng ngƣng kết hồng cầu H ệ th ống chuy ển nhi ễm đư ợc xây d ựng trong nghiên c ứu pHW2000 + N062.NS (1) (+) pHW2000 + N062.M (1) (+) pHW2000 + N062.NP (1) (+) pHW2000 + N062.PA (5) (+) pHW2000 + N062.PB1 (5) (+) pHW2000 + N062.PB2 (5) (+) pHW2000 + VN1203.NA (1) (+) pHW2000 + VN1203.HA (1) (+) Hệ thống plasmid chứng dương (+)
Bảng 3.5 cho thấy tương tự virút A/PR/8/34 được tạo ra từ hệ thống plasmid chứng dương, các virút cúm tạo ra từ một plasmid của hệ thống chuyển nhiễm trong nghiên cứu với bảy plasmid còn lại của hệ thống plasmid chứng dương đều có khả năng làm ngưng kết hồng cầu gà. Ngưng kết hồng cầu thể hiện đặc tính đặc trưng của
55
virút cúm, đồng thời chứng tỏ virút mới có khả năng khuếch đại tốt trên vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phôi). Kết quả này khẳng định mỗi plasmid của hệ thống chuyển nhiễm đều có khả năng tổng hợp vRNA và protein chức năng. Nhận định về sự thay đổi một vài nucleotide trên đoạn ADN nhân dòng trong hệ thống chuyển nhiễm đã không làm thay đổi chức năng protein tương ứng đã được chứng minh.
Kết quả trên khẳng định hệ thống chuyển nhiễm được xây dựng trong nghiên cứu có khả năng tổng hợp virut cúm A.
Kết quả xác định mức độ tương đồng của ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm với ADN đích trước nhân dòng (3.1.3.2 a) cùng với kết quả kiểm tra hoạt động chức năng của mỗi plasmid trong hệ thống chuyển nhiễm (3.1.3.2 b) thể hiện khả năng tổng hợp thành công virút cúm mới rg-A/H5N1 từ hệ thống chuyển nhiễm plasmid mà chúng tôi xây dựng (bảng 3.3).