Xác định thành phần hệ gen của virút cúm rg-A/H5N1 để xác định mức độ chính xác của quá trình thực hiện chuyển nhiễm plasmid tạo virút. Virút rg-A/H5N1 được xác định trình tự nucleotide của tám phân đoạn gen rồi so sánh với trình tự tám đoạn ADN đích. Quá trình giải trình tự này sử dụng hệ thống mồi bảng 2.2. Virút rg- A/H5N1 được tổng hợp từ hệ thống plasmid do đó trước khi tiến hành giải trình tự, mẫu ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1 được kiểm tra sự tồn dư của ADN plasmid trong mẫu.
Độ tinh sạch của mẫu ARN tách chiết từ virút rg-H5N1/H3N2
Thực hiện đồng thời PCR và RT-PCR với cùng một cặp mồi, khuôn là ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1, mức độ tinh sạch của mẫu ARN được nhận định như bảng 3.7.
Bảng 3.7. Mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1
Kết quả PCR Kết quả RT-PCR Thành phần mẫu tách chiết ADN plasmid ARN virút
1 Âm tính Âm tính Không Không
2 Dương tính Dương tính Có Có hoặc không
59
Sử dụng cặp mồi chẩn đoán virút cúm A/H5 để thực hiện phản ứng PCR và RT- PCR, chúng tôi thu được kết quả như sau:
rg E1: virút rg-A/H5N1 PC: chứng dương
Hình 3.8. Kiểm tra mức độ tinh sạch mẫu ARN của virút rg-A/H5N1
Kết quả hình 3.8 cho thấy mẫu ARN tách chiết từ virút rg-A/H5N1 không bị tạp nhiễm với ADN plasmid, hoặc nếu có thì lượng ADN plasmid không đủ để phát hiện được bằng phương pháp PCR và RT-PCR. Mẫu tách chiết ARN này đủ độ tin cậy dùng làm khuôn cho quá trình giải trình tự các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1.
Hệ gen của virút rg-A/H5N1
Tám phân đoạn gen của virútrg-A/H5N1 được tiến hành giải trình tự chuỗi tương tự như quá trình giải trình tự các đoạn ADN đích. Tuy nhiên trong công đoạn này, với mỗi phân đoạn gen chúng tôi chỉ giải trình tự một phần vùng mã hóa dài khoảng 400 – 700 nucleotide với mục đích tiết kiệm thời gian và nguyên vật liệu. Các trình tự chuỗi thu được sẽ được so sánh với trình tự ADN đích trong hệ thống chuyển nhiễm để xác định nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1.
60
Bảng 3.8. Nguồn gốc các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1
Virút rg-A/H5N1 Hệ thống chuyển nhiễm
Số nucleotide sai khác Phân đoạn Vùng giải trình tự ADN đích Vị trí (5’-3’) Chiều dài (bp) NS 30-619 590 NS (A/Hanoi/N062/2007) 0 M 30-649 620 M (A/Hanoi/N062/2007) 0 NP 30-509 480 NP (A/Hanoi/N062/2007) 0 PA 30-609 580 PA (A/Hanoi/N062/2007) 0 PB1 30-459 430 PB1 (A/Hanoi/N062/2007) 1 PB2 30-509 480 PB2 (A/Hanoi/N062/2007) 1 HA 30-619 590 HA (A/Vietnam/1203/2004) 1 NA 30-659 630 NA (A/Vietnam/1203/2004) 0
Bảng 3.8 cho thấy các phân đoạn gen của virút rg-A/H5N1 tương ứng với các đoạn ADN của hệ thống chuyển nhiễm đó là các phân đoạn NS, M, NP, PA, PB1, PB2 của virút A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) và phân đoạn HA, NA của virút A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). Sự khác biệt 1 nucleotide trên vùng so sánh của các phân đoạn PB1, PB2 và HA virút rg-A/H5N1 tuy không có nhiều ý nghĩa trong nghiên cứu này nhưng cũng là điểm cần lưu ý. Khả năng thích ứng của virút cúm trên trứng gà có phôi sau nhiều lần cấy chuyển có thể tạo ra nhiều đột biến và kết quả là sự thay đổi đặc tính kháng nguyên cũng như thụ cảm thể bám của virút cúm [47].
61
Thành phần hệ gen của virút rg-A/H5N1 thu được theo đúng thiết kế của hệ thống chuyển nhiễm đã xây dựng trong nghiên cứu, khẳng định sự lựa chọn quy trình cũng như nguyên vật liệu cho nghiên cứu là phù hợp và đúng mục đích.
Sự thành công của việc xây dựng hệ thống chuyển nhiễm plasmid tổng hợp virút cúm gia cầm-người trong nghiên cứu này cho phép phát triển và thiết kế các hệ thống chuyển nhiễm plasmid khác trên cơ sở các virút cúm lưu hành trên người và động vật tại Việt Nam. Từ đó, phát triển các nghiên cứu về dự báo sự tiến hóa, độc lực, khả năng xuất hiện virút đại dịch cũng như phát triển vaccine phòng bệnh cho tương lai.
3.2. Tìm hiểu đặc tính của virút cúm rg-A/H5N1 (gia cầm – ngƣời)
Quá trình này được thực hiện trong Phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp độ III, Khoa An toàn sinh học và Quản lí chất lượng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
Virút rg-A/H5N1 được tạo ra bằng kỹ thuật di truyền ngược có khả năng ngưng kết với hồng cầu gà thấp (HA = 2) (bảng 3.6). Kết quả trên có thể do sự thích nghi hạn chế của virút với vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phôi) hoặc do sự phối hợp chưa thuần thục của các phân đoạn gen trong quá trình sao chép. Vì vậy chúng tôi tiến hành các thử nghiệm tiếp để xác định chính xác đặc tính của virút mới này và tạo các virút có hiệu giá cao thích hợp, phục vụ cho các nghiên cứu tiếp sau.
3.2.1. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 với tế bào MDCK và trứng gà có phôi.
Dựa vào cấu trúc của các tế bào cảm nhiễm đã biết cũng như đặc tính bám của virút cúm người và virút cúm gia cầm, chúng tôi lựa chọn trứng gà có phôi 10 ngày tuổi và tế bào thận chó MDCK để tiến hành thử nghiệm xác định điều kiện tối ưu cho quá trình thích nghi, sao chép và khuếch đại virút rg-A/H5N1.
Thử nghiệm này được tiến hành đồng thời với các virút gốc (bố, mẹ) đó là A/Hanoi/N062/2007 (H3N2) và A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) trong cùng điều kiện
62
nhiệt độ (330C và 370C) và trên cùng hệ thống cảm nhiễm (trứng gà có phôi 10 ngày tuổi và tế bào thận chó MDCK)
Bảng 3.9. Hiệu giá (HA) virút rg-A/H5N1 khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phôi. Nhiệt độ Chủng virút Tế bào MDCK Trứng gà có phôi D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 330C N062 (H3N2) (-) (-) 4 4 32 (-) (-) (-) VN1203 (H5N1) (-) 2 4 16 64 2 128 rg-A/H5N1 (-) 1 2 8 32 (rg-1) 16 128 (rg-2) 370C N062 (H3N2) (-) (-) 4 4 32 (-) (-) (-) VN1203 (H5N1) (-) 8 32 64 8 128 rg-A/H5N1 (-) 1 4 8 32 (rg-3) 16 128 (rg-4) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
D1 – D5: ngày 1 – ngày 5 sau phân lập virút N062: Virút A/Hanoi/N062/2007
63
a. Trứng gà có phôi
b. Tế bào MDCK
Hình 3.9. Khả năng nhân lên của virút rg-A/H5N1 trong hệ thống cảm nhiễm.
0 16 32 48 64 80 96 112 128 D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 D4 D5 33 độ C 37 độ C N062 (H3N2) VN1203 (H5N1) rgA/H3N2-H5N1 0 10 20 30 40 50 60 70 D1 D2 D3 D4 D5 D1 D2 D3 D4 D5 33 độ C 37 độ C N062 (H3N2) VN1203 (H5N1) rgA/H3N2-H5N1
64
Bảng 3.9 và hình 3.9 cho thấy, tại nhiệt độ 370C, virút cúm gia cầm gốc A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) có khả năng nhân lên tốt trên cả hai hệ thống cảm nhiễm trứng gà có phôi và tế bào MDCK, đạt hiệu giá HA ≥128 trên trứng gà có phôi. Tại nhiệt độ 330C, virút cúm gia cầm gốc tuy vẫn đạt hiệu giá HA=64 trên tế bào MDCK nhưng thời gian kéo dài hơn (5 ngày) so với ở điểu kiện 370
C (4 ngày).
Virút cúm người gốc A/Hanoi/N062/2004 (H3N2) chỉ có khả năng nhân lên trên tế bào MDCK (bảng 3.9) và đạt hiệu giá HA=32 trong cả 2 điều kiện nhiệt độ (330C và 370C).
Virút cúm rg-A/H5N1: đạt hiệu giá HA=32 tại ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm trên tế bào MDCK; đạt hiệu giá HA=128 trên trứng gà có phôi; không có sự ảnh hưởng bởi điều kiện nhiệt độ đối với quá trình khuếch đại trong cả hai hệ thống cảm nhiễm.
Kết quả trên cho thấy, virút rg-A/H5N1 đã thừa hưởng được sự đa dạng về vật chủ cảm nhiễm của virút cúm gia cầm (A/H5N1), tuy nhiệt độ 330C không thích hợp khuếch đại nhanh, nhưng vẫn đạt hiệu quả tốt khi thời gian gây nhiễm kéo dài (5 ngày). Như vậy, khả năng trao đổi và tích hợp di truyền giữa virút cúm gia cầm A/H5N1 và A/H3N2 hình thành virut cúm gia cầm – người trong tự nhiên là có thể. Quá trình nhân lên của virút này trên tế bào biểu mô trên đường hô hấp trên (330C) sẽ hiệu quả nếu thời gian nhiễm kéo dài, và sự lây truyền của virút cúm này thông qua các hạt khí dung (aerosol) sẽ là mối nguy hiểm cho sức khỏe cộng đồng.
3.2.2. Định lượng virút rg-A/H5N1 bằng kỹ thuật plaque (tạo đám hoại tử).
Sau khi khuếch đại trên tế bào MDCK và trứng gà có phôi, nhằm xác định tính ổn định (độ thuần chủng) của virút rg-A/H5N1 và định lượng nồng độ của các virút gây nhiễm này, chúng tôi tiến hành thực hiện kỹ thuật plaque.
Virút sử dụng trong thử nghiệm này là: rg-A/H5N1 (E1M1), virút rg-3 và rg- A/H5N1 (E2), virút rg-4 (bảng 3.9).
65
Lựa chọn virút rg-3 và rg-4 cho thử nghiệm này trên cơ sở hai virút này được
khuếch đại tại nhiệt độ 370C tương đương với nhiệt độ thiết kế cho phản ứng plaque. Bảng 3.10. Định lượng virút rg-3 và rg-4 bằng kĩ thuật plaque.
Độ pha loãng virút
Số plaque trung bình / 100 µl rg-3 (E1M1) (HA = 32) rg-4 (E2) (HA ≥128) 10-2 n 10-3 n 10-4 n n 10-5 3,3 n 10-6 1 n 10-7 0 8,7 10-8 9,3 10-9 3 Hiệu giá (PFU/ml) 10 7 1010,48
(n): không thể xác định được số lượng plaque.
PFU: đơn vị hình thành plaque (plaque-forming unit)
Kết quả cho thấy plaque tạo ra bởi virút rg-3 (E1M1) và rg-4 (E2) không có sự khác biệt về hình dạng và kích cỡ. Các plaque có dạng hình tròn, đường kính 2-3mm. Hiệu giá của virút rg-3 (E1M1) được xác định là 107 PFU/ml, của virút rg-4 (E2) được xác định là 1010,48
PFU/ml (phụ lục 10).
Như vậy, chủng rg-A/H5N1, có 2 đoạn gen của A/H5N1 (cúm gia cầm) và 6 đoạn gen của A/H3N2 (cúm người) có khả năng thích ứng với cả hai hệ thống cảm
66
nhiễm là tế bào MDCK và trứng gà có phôi, trong đó trứng gà có phôi cho hiệu giá virút cao hơn (với cả phương pháp ngưng kết hồng cầu và kĩ thuật plaque).
3.2.3. Khả năng gây bệnh của virút cúm rg-A/H5N1 trên động vật thí nghiệm
Với mục đích tìm hiểu độc tính của virút cúm mới rg-A/H5N1 và so sánh với độc tính của virút A/H5N1 gốc là A/Vietnam/1203/2004, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định liều gây chết 50% động vật thí nghiệm, LD50 (Lethal dose 50%), của virút rg-A/H5N1 trên chuột nhắt Swiss. Virút được sử dụng cho thí nghiệm này là rg- A/H5N1 (E2) (rg-4). Kết quả thí nghiệm được trình bày trong bảng 3.11
Bảng 3.11. Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của virút rg-4 trên chuột Swiss. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lô thí nghiệm Virút gây nhiễm
(PFU/ml) Số cá thể chết Số cá thể sống 1 103 2 3 2 102 2 3 3 101 3 2 4 100 2 3 5 10-1 2 3
6 (đối chứng) Không gây nhiễm (0) (5)
Từ kết quả bảng 3.11, sử dụng phương pháp Reed-Muench xác định giá trị LD50 của virút rg-4 là 101,75 PFU/ml (phụ lục 11). So với giá trị LD50 của virút A/Vietnam/1203/2004 là 102,5 PFU/ml (kết quả nghiên cứu của PTN Cúm năm 2011), virút rg-4 có độc lực mạnh hơn so với virút H5N1 gốc là A/Vietnam/1203/2004. Tuy
67
nhiên, sự khác nhau về giá trị LD50 có thể là do sự khác nhau về động vật thí nghiệm: trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng chuột Swiss trong khi chuột balb/c được sử dụng cho virút A/Vietnam/1203/2004. Do đó, cần nghiên cứu thêm về khả năng nhân lên của virút rg-4 ở biểu mô đường hô hấp trên và hô hấp dưới cũng như ở một số cơ quan khác của động vật thí nghiệm.
68
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi xin đưa ra những kết luận sau:
1. Đã xây dựng được hệ thống chuyển nhiễm gồm tám plasmid có khả năng tổng hợp virút cúm A.
2. Đã tổng hợp được virút cúm mới rg-A/H5N1 từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2 bằng kỹ thuật di truyền ngược.
3. Một vài đặc tính của virút cúm mới rg-A/H5N1 (cúm gia cầm – người) - Mang đặc điểm kháng nguyên của virút cúm gia cầm A/H5N1.
- Có khả năng thích ứng với cả hai hệ thống cảm nhiễm là tế bào MDCK và trứng gà có phôi 10 ngày tuổi ở cả 2 điều kiện nhiệt độ 330C (thích hợp với virút cúm người) và 370
C (thích hợp với virút cúm gia cầm). - Có khả năng lây nhiễm:
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu: 32 HAU (tế bào MDCK) và 128 HAU (trứng gà có phôi 10 ngày tuổi).
Hiệu giá tạo đám hoại tử (plaque): 107 PFU/ml (virut khuếch đại trên trứng gà có phôi 10 ngày tuổi) và 1010,48 PFU/ml (virut khuếch đại trên tế bào MDCK).
69
ĐỀ XUẤT
Bên cạnh những mục tiêu nghiên cứu đã đạt được, chúng tôi xin có những đề xuất sau:
1. Hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm A sử dụng trong nghiên cứu có thể được áp dụng để thiết kế các hệ thống chuyển nhiễm tạo virút cúm A khác từ các virút cúm đang lưu hành trên người.
2. Tiếp tục phát triển các nghiên cứu về khả năng gây bệnh, độc lực, khả năng đáp ứng với thuốc kháng virút của virút rg-A/H5N1 để hiểu rõ các đặc điểm virút học cũng như những biện pháp dự phòng và điều trị phù hợp đối với những virút có đặc tính tương tự.
70
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Nguyễn Lê Khánh Hằng (2010), "Nghiên cứu căn nguyên của các vụ dịch cúm người đầu những năm 2000 tại miền Bắc Việt Nam", Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên.
2. Nguyễn Trần Hiển và cs (2012), "Cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam", Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
3. Phạm Văn Ty (2007), "Virut học", Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội.
Tiếng Anh
4. 1. H5N1 Influenza Virus Vaccine, A/Vietnam/1203/2004 (Clade 1):
http://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/07/briefing/2007-4282B1_01.pdf.
5. Acheson, N.H. (2007), "Orthomyxoviruses" Fundamentals of Molecµlar Virology, pp. 248–260. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
6. Bouback, T.A.F. and Redwan, N.A. (2011), "Approaches toward the development of DNA vaccine for influenza virus", Afr. J. Biotechnol., 10(26), pp. 5209–5218.
7. Changa, L.Y. et al. (2009), "Novel Swine-origin Influenza Virus A (H1N1): The First Pandemic of the 21st Century", Journal of the Formosan Medical Association, 108(7), pp. 526–532.
8. Chen W, Calvo PA, Malide D, Gibbs J, Schubert U, Bacik I, Basta S, O’Neill R, Schickli J, Palese P, Henklein P, Bennink JR, Y.J. (2001), "A novel influenza A virus mitochondrial protein that induces cell death.", Nat Med., 7(12), pp. 1306– 12.
9. Coleman, J.R. (2007), "The PB1-F2 protein of Influenza A virus: increasing pathogenicity by disrupting alveolar macrophages.", Virology journal, 4(1), pp. 1–5.
10. CPVietNam.pdf:
71
11. Cross, K.J. et al. (2001), "Mechanisms of cell entry by influenza virus.", Expert reviews in molecµlar medicine, 3(21), pp. 1–18.
12. Cumµlative Number H5N1 cases:
http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/EN_GIP_20120810Cum µlativeNumberH5N1cases.pdf.
13. Elton, D. et al. (2001), "Interaction of the Influenza Virus Nucleoprotein with the Cellµlar CRM1-Mediated Nuclear Export Pathway", J. Virol., 75(1), pp. 408– 419.
14. Fang, R. et al. (1981), "Complete structure of A/duck/Ukraine/63 influenza hemagglutinin gene: Animal virus as progenitor of human H3 Hong Kong 1968 influenza hemagglutinin", Cell, 25(2), pp. 315–323.
15. Flu.gov "Pandemic Flu History":
http://www.flu.gov/pandemic/history/index.html#
16. Gabriele Neumann, T.W. et al. (1999), "Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, pp. 9345–9350. 17. Gabriele Neumann, Takeshi Noda, and Y.K. (2010), "Emergence and pandemic
potential of swine-origin H1N1 influenza virus", Nature, 459(7249), pp. 931– 939.
18. Gall, A. et al. (2008), "Universal primer set for amplification and sequencing of HA0 cleavage sites of all influenza A viruses.", Journal of clinical microbiology, 46(8), pp. 2561–7.
19. Hoffmann, E. et al. (2000), "A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97(11), pp. 6108–13.
20. Hutchinson, E.C. et al. (2010), "Genome packaging in influenza A virus.", The