Quá trình này được thực hiện trong Phòng thí nghiệm An toàn sinh học cấp độ III, Khoa An toàn sinh học và Quản lí chất lượng, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.
3.1.4.1.Tổng hợp virút cúm rg-A/H5N1
Virút cúm mới rg-A/H5N1 được tổng hợp bằng cách chuyển nhiễm hệ thống tám plasmid đã xây dựng vào tế bào 293T nhờ Lipofectamine (Invitrogen). Sau 3 ngày chuyển nhiễm, nước nổi tế bào của mỗi mẫu chuyển nhiễm (chứa virút rg-A/H5N1) được cấy vào 03 trứng gà có phôi 10 ngày tuổi. Sau 48 giờ, dịch niệu trong trứng gà có phôi được thu thập và thực hiện phản ứng ngưng kết hồng cầu gà.
56
Bảng 3.6. Phát hiện virút rg-A/H5N1 tổng hợp từ hệ thống tám plasmid thông qua khả năng ngưng kết hồng cầu.
Mẫu Virút tổng hợp Khả năng ngƣng kết
hồng cầu của virút
Chứng dƣơng (A/PR/8/34) Trứng 1 HA≥ 128 Trứng 2 HA=64 Trứng 3 HA=64 rg-A/H5N1 Trứng 1 HA (-) Trứng 2 HA=2 Trứng 3 HA (-)
Tương tự trong quá trình đánh giá chức năng mỗi plasmid của hệ chuyển nhiễm, chúng tôi sử dụng hệ thống chuyển nhiễm thiết kế cho virút A/PR/8/34 (H1N1) trong plasmid pHW2000 làm chuẩn (chứng dương). Trong thí nghiệm này, virút cúm rg- A/PR/8/34 được tổng hợp thành công và đạt hiệu giá tối thiểu 64 khi khuếch đại trực tiếp trên trứng gà có phôi 10 ngày tuổi.
Trong cùng điểu kiện chuyển nhiễm, so với virút rg A/PR/8/34 chuẩn, vi rút rg-A/H5N1 cũng được tổng hợp thành công bằng hệ chuyển nhiễm xây dựng trong nghiên cứu và đạt hiệu giá HA=2 (trứng số 2).
Kết quả khuếch đại virút trực tiếp từ nước nổi tế bào 293T trong trứng gà có phôi cho kết quả khác nhau (bảng 3.6). Hiệu giá HA thu được của virút rg-A/PR/8/34
57
đạt từ 64 đến ≥128 trong toàn bộ 3 cá thể trứng (100%), trong khi virút rg-A/H5N1 chỉ được khuếch đại thành công trên 1 cá thể trứng (33,3%) và đạt hiệu giá HA=2. Như vậy, virút rg-A/H5N1 mới tổng hợp thể hiện khả năng thích ứng và khuếch đại còn hạn chế trong trứng gà có phôi.
Khả năng khuếch đại và đạt hiệu giá HA cao trong vật chủ cảm nhiễm (trứng gà có phôi, tế bào MDCK) phụ thuộc vào đặc tính của từng phân típ của virút cúm, đặc biệt là thụ cảm thể của virút với tế bào cảm nhiễm. Thụ cảm thể của virút cúm được xác định bởi một số axit amin trên protein HA và tạo ra sự tương thích với thụ cảm thể axit sialic của tế bào chủ. Virút cúm người thường có xu hướng gắn bám vào thụ cảm thể alpha 2,6 (SA α 2,6Gal) trong khi virút cúm gia cầm lại thích hợp kiểu alpha 2,3
(SA α 2,3Gal). Trong nghiên cứu của Ito, T. và cs năm 1997, trong trứng gà có phôi, thụ cảm thể SA α 2,3Gal được phát hiện trong cả 2 loại tế bào túi niệu (allatoic) và màng ối (amniotic) trong khi thụ cảm thể SA α 2,6Gal chỉ phát hiện trên tế bào màng ối [22]. Virút cúm rg-A/H5N1 mang protein HA của virút cúm gia cầm A/H5N1 vì vậy sẽ tương thích với kiểu thụ cảm thể SA α 2,3Gal trong tế bào chủ. Tuy nhiên, kết quả trong nghiên cứu sau một lần khuếch đại chỉ đạt hiệu quả 33,3% và hiệu giá HA thấp (HA=2), trong khi với virút rg-A/PR/8/34 đạt hiệu quả 100% và hiệu giá HA ≥128. Sự khác biệt này có thể giải thích do virút rg-A/H5N1 được tích hợp từ virút cúm A/H5N1 và A/H3N2, vì vậy virút mới không thuần chủng như A/PR/8/34 cho nên sự phối hợp trong quá trình thích nghi, sao chép và khuếch đại trong tế bào cảm nhiễm chưa thuần thục vì vậy kết quả thu được hạn chế. Khả năng thích ứng của virút rg-A/H5N1 có thể cải thiện nếu tiếp tục khuếch đại nhiều lần trên trứng gà có phôi. Ngoài ra, sự có mặt trong 6 gen của virút cúm người A/H3N2 trong virút rg-A/H5N1cũng có thể ảnh hưởng đến khả năng sao chép và khuếch đại của virút này khi tỷ lệ phân lập virút cúm A/H3N2 trên trứng gà có phôi chỉ đạt từ 0-7,6% trong khi tỷ lệ này có thể đạt từ 58,0% -71,0% khi tiến hành phân lập trên tế bào cảm nhiễm MDCK [35].
58
Tuy kết quả thu được trong nghiên cứu còn khiêm tốn nhưng đã khẳng định hệ thống chuyển nhiễm plasmid đã xây dựng cho phép tổng hợp thành công virút cúm có các phân đoạn gen của virút cúm gia cầm A/H5N1 và virút cúm người A/H3N2 lưu hành tại Việt nam. Virút mới rg-A/H5N1 mang đặc tính cơ bản của virút cúm đó là khả năng nhân lên trong vật chủ cảm nhiễm và gây ngưng kết với hồng cầu gà.