Mục đích:
- Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN đích tổng hợp từ gen đích (trước nhân dòng) - Xác định trình tự nucleotide các đoạn ADN đích trong plasmid (sau nhân dòng)
- Xác định trình tự nucleotide các phân đoạn gen của virút cúm tổng hợp bằng hệ thống chuyển nhiễm ADN plasmid
Chu kì nhiệt tạo các đoạn ADN gắn dideoxynucleotide (Cycle sequencing)
Sử dụng sinh phẩm BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N.
Thành phần phản ứng
Thành phần Thể tích (µl)
Terminator Ready Reaction Mix ADN
Mồi (3,2 pmol) xuôi hoặc ngược Nước cất tinh sạch 8 2 1 9 Tổng 20
Ly tâm nhẹ hỗn hợp phản ứng trước khi cho vào máy PCR.
Chu trình nhiệt của phản ứng:
Nhiệt độ Thời gian (phút:giây) Số chu kì
960C 1:00 1 960C 500C 600C 0:10 0:05 4:00 25
32
Tinh sạch sản phẩm sau khi chạy chu trình nhiệt gắn dideoxynucleotide
- Mục đích: loại bỏ các dideoxynucleotide và sinh phẩm dư thừa, tránh nhiễu trong quá trình giải trình tự.
- Sử dụng bộ sinh phẩm DyeEx 2.0 Spin kit Qiagen (Cat.No: 63206) theo hướng dẫn kèm theo bộ sinh phẩm.
Điện di qua mao quản và đọc trình tự nucleotide bằng đầu đọc laser
- Cho 10 µl HiDi Formamide (HiDi Formamide ABI 25 ml P/N: 4311320) vào tuyp 1.5 ml chứa ADN sau khi làm khô (2.3.4.2)
- Chuyển toàn bộ sản phẩm sang phiến 96 giếng (phiến chuyên dùng cho ABI PRISM 3100 – Avant)
- Ủ phiến ở 960C trong 5 phút - Chuyển phiến vào giá giữ lạnh
- Đặt phiến 96 giếng vào máy ABI PRISM 3100 – Avant
- Cài đặt chương trình chạy, thu kết quả từ tệp dữ liệu khi phản ứng kết thúc.
Phân tích các trình tự chuỗi thu đƣợc.
Sử dụng phần mềm phân tích DNAstar và SeqMan để phân tích các trình tự chuỗi thu được: nối các đoạn nucleotide thành một đoạn gen hoàn có chiều dài đầy đủ; kiểm tra cấu trúc gen (chiều dài gen, chiều dài ORF, vùng không mã hóa).