Tiến hành

Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 5 lần lặp lại

Chiết 200 ml môi trường vào các bình tam giác (500 ml) đem thanh trùng autoclave 1210 C trong 20 phút.

Cho bình tam giác có chứa môi trường King’s vào water path để ổn định nhiệt độ (50 – 520C). Cho chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. (nhân nuôi 48h trước) với mật số 109

cfu/ml vào bình tam giác có chứa môi trường King’s đã được ổn định nhiệt độ, khuấy đều.

Sử dụng bình tam giác có chứa vi khuẩn Xanthomonas sp. đỗ ra đĩa petri (21 đĩa)

Dùng kẹp (đã hơ trên ng n lửa đèn cồn) gấp giữ các khoanh giấy thấm có tẩm các loại thuốc trong thí nghiệm trên thành ống nghiệm để ráo nước, sau đó đặt khoanh giấy thấm vào đĩa petri (đã có vi khuẩn) gây bệnh thành 5 điểm (đối chứng được đặt trước giữa) lần lượt cho khoanh giấy của 4 nghiệm thức (2 nồng độ của 2 loại thuốc) xếp cách đều đối chứng 2,5 cm trên môi trường. Đĩa thử thuốc được đặt trong tủ úm với nhiệt độ 300C.

Hình 2.1: Sơ đồ thử nghiệm 8 loại thuốc và 2 VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm

Ghi chú: ĐC : khoanh giấy thấm nước cất vô trùng 1A, 1B, 2A, 2B : khoanh giấy thấm có tẩm thuốc hoặc VKVR 2.2.1.3 Cách lấy chỉ tiêu

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Đo bán kính vành vô khuẩn vi khuẩn bị ức chế

+ Cách lấy chỉ tiêu: Đo khoảng cách từ tâm khoanh giấy thấm thuốc đến vị trí khuẩn lạc vi khuẩn bị ức chế tại thời điểm theo dõi.

+ Thời gian lấy chỉ tiêu lúc 12h, 24h, 48h, 72h và 96h sau khi xử lý.

+ Bán kính vành vô khuẩn được đánh giá theo thang đáng giá của Jackson et al. (1991).

1: đối kháng phát triển phủ trên mầm bệnh và mầm bệnh ngừng phát triển. 2: Mầm bệnh phát triển vượt trội đối kháng và đối kháng bị dừng lại. 3: Ức chế lẫn nhau với vùng ức chế 1-3 mm.

4: Ức chế mạnh >4 mm.

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá gừng do

Xanthomonas sp. của một số loại thuốc hóa học và 2 vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện ngoài nhà lưới

* Mục tiêu: Xác định loại thuốc có hiệu quả trong phòng trị bệnh cháy bìa lá gừng trong điều kiện nhà lưới.

2.2.2.1 Chuẩn bị

- Chuẩn bị môi trường King’s .

ĐC

- Trồng cây gừng được 2,5 tháng tuổi.

- a loại thuốc hóa h c có hiệu quả ức chế nấm nhất và 2 chủng Bacillus.

2.2.2.2 Tiến hành

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại, 6 nghiệm thức (3 loại thuốc 2 loại vi khuẩn và 1 đối chứng).

* Cách thực hiện:

- Ủ hom gừng: Dùng tay bẻ các đoạn củ có chứa khoảng 2 mắt mầm sau đó khử trùng bằng Ca(OCl)2 1% trong 15 phút, vớt ra để ráo. Ủ hom gừng giống nơi có bóng râm, xếp ủ trên nền cao ráo, thoát nước tốt và được phủ lên trên một lớp tro trấu. Tưới nước vừa đủ ẩm giúp hom nẩy mầm.

- Chuẩn bị đất trồng:

Trộn hổn hợp đất trồng với tỉ lệ 2 đất : 1 phân chuồng hoai : 1 rơm hoai mục.

Đục lổ nhỏ dưới đáy bao để thoát nước sau đó cho hổn hợp đất trồng đã trộn đều vào bao với độ dày khoảng 40 cm.

Xử lý đất bằng Ca(OCl)2 5% có phủ nilon kín trong 15 ngày trước khi trồng.

- Tiến hành trồng và chăm sóc:

Bảng 2.2: Liều lượng các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm

STT Tên thuốc Nồng độ khuyến

cáo(%) 1 Starner 20WP 0,125 2 Avalon 200 0,0875 3 Stepguard 200 TB 0,1 4 B. amyloquefaciens Huyền phù 108 bào tử/ml

5 Brevibacillus brevis Huyền phù 108

bào tử/ml

Gừng được trồng trong bao (kích thước 35x35 cm chứa khoảng 11 kg đất/bao) với số lượng 3 cây/ bao, trong điều kiện nhà lưới và được bón phân với liều lượng: NPK 20-20-15, liều lượng 1,3g/bao/lần bón - 2 tuần.

Chăm sóc khác: Tưới nước, nhổ cỏ và vô thêm đất cho cây.

2.2.2.3 Cách lấy chỉ tiêu

Lấy chỉ tiêu 5 cây/b c (bao) và được làm dấu để lấy cố định.

Đo chiều cao cây các thời điểm trước xử lý. 3, 5, 7 ngày sau xử lý lần 1, 14 và 21ngày sau xử lý lần 2.

* Đánh giá bệnh

Trên mỗi cây đo chiều cao cây và chiều dài vết bệnh các thời điểm trước, 3, 5 và 7 ngày sau xử lý lần 1, 14 và 21 ngày sau xử lý lần 2. Từ đó, ta tính được tỷ lệ (%) diện tích cây nhiễm bệnh theo công thức của Gnanamanickam et al.,

(1999) như sau:

TLB(%) = DVB / DL x 100

Trong đó: * TL : tỷ lệ nhiễm bệnh. * DL: chiều cao cây. * DV : chiều dài vết bệnh.

- Từ tỷ lệ diện tích cây nhiễm bệnh, tính hiệu quả giảm bệnh theo công thức HQG (%) = [(TL iđc – TL i)] / TL đc x 100

* TL iđc: tỷ lệ nhiễm bệnh trung bình đối chứng lần lặp lại thứ i (%) * TL i: tỷ lệ nhiễm bệnh lần lặp lại thứ i (%)

- Kết thúc lấy chỉ tiêu khi đối chứng chết hoàn toàn.

2.3 Xử lý số liệu

Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý sơ bộ (chuyển đổi số liệu, tính trung bình,...), bằng chương trình Microsoft Excel 2003. Các phân tích thống kê như phân tích phương sai (Analysis of Variance), so sánh, kiểm định sự khác biệt P = 0,05 giữa các trung bình nghiệm thức, trung bình các nhân tố được tính theo phép thử Duncan (Duncan’s Multiple Range Test) nhờ vào chương trình MSTAT-C.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

GHI NHẬN TỔNG QUÁT

Nhiệt độ cao và mưa nhiều có ảnh hư ng đến mức độ gây hại của bệnh. Với từng loại thuốc và từng chủng VKVR khác nhau mà có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty của nấm cũng khác nhau.

3.1 Đánh giá khả năng đối kháng của một số loại thuốc hóa học và vi khuẩn vùng rễ đối với Xanthomonas sp. trong điều kiện in vitro. vùng rễ đối với Xanthomonas sp. trong điều kiện in vitro.

Hiệu quả của thuốc và VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. được đánh giá thông qua bán kính vành vô khuẩn với vi khuẩn Xanthomonas sp..

Hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh của 7 loại thuốc hóa h c và 2 VKVR bắt đầu thể hiện từ thời điểm 12 giờ sau thí nghiệm.

3.1.1 Thời điểm 12 giờ sau thí nghiệm (12GSTN)

* Bán kính vòng vô khuẩn

Kết quả từ ảng 3.1 cho thấy, nghiệm thức xử lý với STEPGUARD 200 TB (Streptomycin sulphate) tạo ra bán kính vòng vô khuẩn lớn nhất (1,095 cm) khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Kế đến STARNER 20 WP (Oxolinic acid 20%), AVALON 8 WP (Oxytetracycline Hydrochloride 6% và Gentamicine Sulfate 2%) cũng có bán kính vòng vô khuẩn lớn lần lượt là: 0,975 cm và 0,498 cm khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Các nghiệm thức còn lại gồm LUSATEX 5 SL (Ningnanmycin 10%), ANTI – XO 200 WP (Bismerthiazol), AGOFAST 80WP (Aluminium tris (O-ethyl phosphonate)), KASUMIN 2SL ([5- Amino- 2- metyl- 6- (2, 3, 4, 5, 6- pentahidroxi- clohexyloxi) tetrahidropyran- 3- yl] amino—iminoaxetic axit), đều không tạo bán kính vòng vô khuẩn và khác biệt không có ý nghĩa với nhau và nghiệm thức đối chứng.

Vi khuẩn Brevibacillus brevis và B. amyloliquefaciens có bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 0,333 cm và 0,403 cm khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng.

Ở 2 nồng độ thì bán kính vòng vô khuẩn khác biệt không có ý nghĩa các nghiệm thức. Tuy nhiên, đối với nghiệm thức Avalon 8 WP và B. amyloliquefaciens thì 2 nồng độ bán kính vòng vô khuẩn khác biệt có ý nghĩa.

Trong đó, nồng độ N1 thì Stepguard 200TB có bán kính vòng vô khuẩn lớn nhất (1,095 cm) trong các nghiệm thức và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm

thức còn lại. Starner 20WP có bán kính vòng vô khuẩn lớn thứ hai (0,960 cm) cũng khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Riêng Avalon 8 WP có bán kính vòng vô khuẩn là 0,410 cm, khac biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại (trừ 2 nghiệm thức B. amyloliquefaciens và Brevi bacillusbrevis). Còn

nồng độ N2 thì bán kính vòng vô khuẩn của Stepguard 200TB, Starner 20WP, Avalon 8WP lần lượt là 1,095 cm, 0,990 cm, 0,585 cm khác biệt có ý nghĩa so với nhau và các loại thuốc còn lại.

Vi khuẩn Brevibacillus brevis có bán kính vòng vô khuẩn 2 nồng độ

khác biệt không có ý nghĩa so với nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Còn vi khuẩn B. amyloliquefaciens có bán kính vòng vô khuẩn 2 nồng độ khác biệt có ý nghĩa so với nhau và so với đối chứng.

ảng 3.1: án kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc và VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. thời điểm 12GSTN

Loại thuốc (A) án kính các nồng độ xử lý

LUSATEX N1 0,00 F N2 0,00 F AVALON N1 0,41 DE N2 0,59 C STARNER N1 0,96 B N2 0,99 B ANTI – XO N1 0,00 F N2 0,00 F ANGOFAST N1 0,00 F N2 0,00 F KASUMIN N1 0,00 F N2 0,00 F STEPGUARD N1 1,10 A N2 1,10 A B. amyloliquefaciens 10 6 0,48 D 108 0,33 E Brevibacillus brevis 10 6 0,32 E 108 0,36 E Đối chứng 0,00 F Ý nghĩa F ** CV (%)= 21,65%

Ghi chú: Trong cùng bảng các số liệu trung bình được theo sau bởi một hay những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan. N1: Nồng độ thuốc khuyến cáo; N2:nồng độ thuốc gấp đôi khuyến cáo

3.1.2 Thời điểm 24GSTN

* Bán kính vòng vô khuẩn

Tại thời điểm này bán kính vùng vi khuẩn Xanthomonas sp. bị ức chế do 3 loại thuốc có hiệu quả và 2 chủng VKVR xử lý thời điểm 12h đều tăng (bảng 3.2), có khác biệt ý nghĩa so với các loại thuốc còn lại và đối chứng. Stepguard 200TB vẫn có bán kính vòng vô khuẩn lớn nhất (1,253 cm), thứ hai là Starner 20WP (1,100 cm), kế đến là Avalon 8WP (0,508 cm). Trong khi đó, các loại thuốc còn lại hầu hết không có hiệu quả và không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.

Hai vi khuẩn Brevibacillus brevis và B. amyloliquefaciens vẫn còn hiệu quả và có bán kính vành vô khuẩn lần lược là 0,410 cm và 0,438 cm, khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng.

án kính vòng vô khuẩn 2 nồng độ thì khác biệt có ý nghĩa đối với Avalon 8 WP, B. amyloliquefaciens và khác biệt không ý nghĩa đối với Starner

20WP, Stepguard 200TB, Brevibacillus brevis. Nghiệm thức xử lý thuốc nồng độ gấp đôi khuyến cáo của các loại thuốc Avalon 8WP, Starner 20WP, Stepguard 200TB có bán kính vòng vô khuẩn lớn hơn nghiệm thức xử lý nồng độ khuyến cáo N1.

Vi khuẩn Brevibacillus brevis có bán kính vòng vô khuẩn nồng độ N2

(0,420 cm) lớn hơn nồng độ N1 (0,400 cm). Tuy nhiên, nghiệm thức xử lý với vi khuẩn B. amyloliquefaciens lại có bán kính vòng vô khuẩn nồng độ N1 lớn hơn bán kính vòng vô khuẩn nồng độ N2.

Bảng 3.2: Bán kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc và VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. ở thời điểm 24GSTN

Loại thuốc (A) án kính các nồng độ xử lý

LUSATEX N1 0,00 G N2 0,00 G AVALON N1 0,43 EF N2 0,59 D STARNER N1 1,10 C N2 1,11 BC ANTI – XO N1 0,00 G N2 0,00 G ANGOFAST N1 0,00 G N2 0,00 G KASUMIN N1 0,00 G N2 0,00 G STEPGUARD N1 1,24 AB N2 1,27 A B. amyloliquefaciens 10 6 0,53 DE 108 0,36 F Brevibacillus brevis 10 6 0,40 EF 108 0,42 EF Đối chứng 0,00 G Ý nghĩa F ** CV (%)= 28,32%

Ghi chú: Trong cùng bảng các số liệu trung bình được theo sau bởi một hay những chữ cái giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê trong phép thử Duncan

3.1.3 Thời điểm 48GSTN

* án kính vô khuẩn

Kết quả bảng 3.3 cho thấy, sau khi xử lý thời điểm 48h thì bán kính vòng vô khuẩn vẫn còn lớn các nghiệm thước xử lý với Starner 20WP, Stepguard 200TB theo bán kính vô khuẩn lần lượt là 1,365 cm, 1,453 cm , khác biệt có ý nghĩa so với các loại thuốc còn lại và đối chứng. Riêng nghiệm thức xử lý với Avalon 8WP bán kính vòng vô khuẩn là 0,455 cm cho thấy hiệu quả đang bắt đầu giảm thời điểm 48h. Và 2 nghiệm thức xử lý với vi khuẩn Brevibacillus

brevis và B. amyloliquefaciens tại thời điểm này cùng cho bán kính vòng vô khuẩn lớn hơn thời điểm xử lý trước và khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng.

Cũng từ kết quả bảng 3.3 ta thấy, các nghiệm thức xử lý 2 nồng độ có bán kính vòng vô khuẩn khác biệt nhau (trừ Stepguard). Đối với các nghiệm thức xử lý với thuốc, bán kính vòng vô khuẩn nồng độ N2 luôn lớn hơn nồng độ N1.

Hình 3.1: Hiệu quả 3 loại thuốc và 2 loại VKVR ở thời điểm 24 giờ sau thí nghiệm

Stepguard (N1) Stepguard (N2) Avalon (N1) Avalon (N2) Starner (N2) Starner (N1) Bacillus (N1) Bacillus (N2) Brevis (N1) Brevis (N2)

Ngược lại các nghiệm thức xử lý với vi khuẩn, kết quả cho thấy bán kính nồng độ N1 lớn hơn nồng độ N2.

Bảng 3.3: Bán kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc và VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. ở thời điểm 48GSTN

Loại thuốc (A) án kính các nồng độ xử lý

LUSATEX N1 0,00 E N2 0,00 E AVALON N1 0,37 D N2 0,54 C STARNER N1 1,27 B N2 1,46 A ANTI – XO N1 0,00 E N2 0,00 E ANGOFAST N1 0,00 E N2 0,00 E KASUMIN N1 0,00 E N2 0,00 E STEPGUARD N1 1,41 A N2 1,50 A B. amyloliquefaciens 10 6 0,59 C 108 0,44 D Brevibacillus brevis 10 6 0,42 D 108 0,41 D Đối chứng 0,00 E Ý nghĩa F ** CV (%)= 17,90%

3.1.4 Thời điểm 72GSTN

* án kính vô khuẩn

Tới thời điểm này, các loại thuốc vẫn còn hiệu quả. Tuy nhiên, bán kính vòng vô khuẩn các nghiệm thức đang giảm dần lần lượt là Avalon (0,430 cm), Starner (1,358 cm), Stepguard (1,443 cm) và khác biệt có ý nghĩa so với các loại thuốc còn lại và đối chứng. Vi khuẩn B. amyloliquefaciens và Brevibacillus brevis vẫn còn hiệu quả và bán kính vô khuẩn lần lượt là 0,413 cm, 0,355 cm.

Trong khi đó các nghiệm thức còn lại không có khả năng ức chế mầm bệnh và không khác biệt ý nghĩa so với đối chứng.

Khi so sánh thuốc các nồng độ xử lý tại thời điểm 72 giờ sau xử lý thì N1 và N2 có bán kính vô khuẩn không khác biệt với nhau nghiệm thức

Brevibacillus brevis và khác biệt có ý nghĩa đối với các nghiệm thức còn lại

(Avalon, Starner, Stepguard, Bacillus amiloliquefaciens). Và các nghiệm thức xử

Hình 3.2: Hiệu quả 3 loại thuốc và 2 loại VKVR ở thời điểm 48 giờ sau thí nghiệm

Avalon (N1) Avalon (N2) Starner (N1) Starner (N2) Stepguard (N1) Stepguard (N2) Bacillus (N1) Bacillus (N2) Brevis (N1) Brevis (N2)

lý nồng độ N2, luôn có bán kính vòng vô khuẩn lớn hơn nghiệm thức xử lý nồng độ N1 (trừ nghiệm thức xử lý với Brevi bacillusbrevis).

Bảng 3.4: Bán kính vòng vô của các loại thuốc và VKVR đối với vi khuẩn

Xanthomonas sp. ở thời điểm 72GSTN

Loại thuốc (A) án kính các nồng độ xử lý

LUSATEX N1 0,00 F N2 0,00 F AVALON N1 0,37 E N2 0,49 C STARNER N1 1,25 B N2 1,47 A ANTI – XO N1 0,00 F N2 0,00 F ANGOFAST N1 0,00 F N2 0,00 F KASUMIN N1 0,00 F N2 0,00 F STEPGUARD N1 1,40 A N2 1,49 A B. amyloliquefaciens 10 6 0,47 CD 108 0,36 E Brevibacillus brevis 10 6 0,34 E 108 0,37 DE Đối chứng 0,00 F Ý nghĩa F ** CV (%)= 21.65%

 Thảo luận chung

Qua thí nghiệm đánh giá hiệu quả ức chế của thuốc và vi khuẩn vùng rễ đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. trên môi trường King’ trong điều kiện in vitro cho thấy khả năng ức chế của một số loại thuốc và 2 chủng VKVR đối với

sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh các mức độ khác nhau được thể hiện qua bán kính vòng vô khuẩn. Đến thời điểm 72 giờ sau thí nghiệm các nghiệm thức xử lý với 3 loại thuốc Avalon 8WP, Starner 20WP, Stepguard 200TB duy trì khả

Đặc điểm vi khuẩn thuộc chi Bacillus