Bacillus có dạng hình que với kích thước 1,0 – 1,2 x 3,0– 5 µm, gram dương, không có lớp capsule, hiếu khí. Vi khuẩn tạo nội bào tử có kích thước 1,0 x 1,5 µm (Cook and ake, 1989, trích dẫn b i Trần Thị Thúy Ái, 2011). Khuẩn lạc của vi khuẩn chi Bacillus thường có màu hoặc không màu, mặt khuẩn lạc
nhăn. Trong môi trường lỏng chúng tạo thành lớp nhăn, đục và lỏng cặn (Dương Văn Điệu, 1989).
Bacillus có những nét đặc trưng riêng biệt, phân bố rộng rãi trong đất, có
khả năng chịu đựng nhiệt độ cao, có thể phát triển nhanh trong môi trường lỏng và hình thành nội bào tử trong điều kiện khắc nghiệt. Vi khuẩn này được đánh giá hội tụ những tính năng căn bản trong việc ức chế bệnh cây trồng. Chúng được xem như là những tác nhân sinh h c an toàn và có tiềm năng cao trong phòng trừ sinh h c bệnh cây (Silo-suh et al., 1994, trích dẫn b i Trần Thị Thúy Ái, 2011).
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đa dạng về sinh thái. Các loài thuộc chi Bacillus đã và đang tr thành những vi sinh vật quan tr ng hàng đầu về mặt ứng dụng (Ngô Tự Thành và ctv., 2009). Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có tiềm năng lớn về khả năng tiết các enzyme ngoại bào, trong đó có nhiều enzyme có khả năng thủy phân các phân tử hữu cơ, chính vì thế Bacillus có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau (Gupta et al., 2002).
Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Bacillus spp. Có khả năng sản xuất một lượng lớn các chất kháng sinh như, gramicidin S, polymyxin, tyrotricidin, bacilysin, chlotetaine, iturin A, mycobacillin, bacilomycin, mycosubtilin, fungistatin và subsporin có thể kiểm soát các bệnh cây trồng (Intana et al., 2008, trích dẫn b i Trần Thị Thúy Ái, 2011).
Cả hai loài vi khuẩn Brevibacillus brevis và Bacillus amyloliquefaciens đều
có khả năng tiết siderophore dạng hydroxymate. Ngoài ra, cả hai loài vi khuẩn này đều có khả năng kiểm soát bệnh héo xanh thối củ gừng do vi khuẩn Ralstonia
solanacearum. gây ra trong điều kiện nhà lưới (Trần Văn Nhã, 2011).
1.4.1 Bacillus amyloliqueciens
B. amyloliquefaciens có khả năng kích kháng phổ rộng, kháng lại với mầm
bệnh do vi rus, vi khuẩn và nấm gây ra, có hiệu quả cao trong kiểm soát bệnh héo xanh do vi khuẩn Ralstonia solanacearum và héo do nấm Fusarium spp. trên cà
chua (Park et al., 2003).
B. amyloliquefaciens có liên quan đến cơ chế induced systemic resistance
(ISR), chất L-pro-L-Tyr được tìm thấy sau khi xử lí với B. amyloliquefaciens và đã được chứng minh có liên quan đến kích hoạt các phản ứng tự vệ của cây trồng chống lại mầm bệnh trong nghiên cứu kích kháng chống bệnh thán thư trên dưa chuột. Hợp chất 2,3-butanediol cũng đã được chứng minh là có liên quan đến sự kích kháng ISR của vi B. amyloliquefaciens (Park et al., 2003).
Sự tác động đến cơ chế ISR của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens được
kiểm soát b i gen srfA và pps operon và cơ chế PGP được kiểm soát b i gen alsS và alsD (Hardoim et al., 2008).
Kháng sinh Iturin A2 tiết ra từ vi khuẩn B. amyloliquefaciens RC_2 có khả
năng ức chế nấm Rosellina necatrix, Pyricularia oryzae,và vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, Xanthomonas campestris pv. campestris, đã cho thấy Bacillus amyloliquefaciens RC_2 có tác dụng phổ rộng đối với bệnh hại cây
trồng. (Yoshida et al., 2002).
B. amyloliquefaciens GA1 có thể sản sinh đồng thời surfactin, iturin A,
fengycin A và fengycin . Đây là những lipopeptides vòng (CLP) gồm bảy (surfactin và iturin A) hoặc 10 α-amino axit (fengycins) liên kết với một-amino β (iturins) hoặc β-hydroxy (surfactins và fengycins) axit béo có thể thay đổi từ C-13 C-16 cho surfactins, từ C-14 C-17 cho iturins và từ C-14 C-18 cho fengycins (Arguelles-Arias et al., 2009).
Ba loài vi khuẩn B. subtilis, B. amyloliquefaciens và B. megaterium đối kháng với phytopthora pamivora gây bệnh thối đ t dừa. Trong đó B. amyloliquefaciens
cho hiệu quả cao nhất trong điều kiện invitro (Jayasuja và Iyer, 2003).
Nghiên cứu của Luz (2003), chứng minh vi khuẩn B. amyloliquefaciens cho
kết quả cao với việc giúp cây lúa mì razil tăng năng suất từ 459 đến 594 kg/ha và có liên quan đến kích kháng, hạn chế sự gây hại của những vi sinh vật gây bệnh từ 17,3 đến 22,4 %.
Ngoài việc kiểm soát bệnh do phytophthora và Fusarium gây ra, vi khuẩn
vùng rễ B. amyloliquefaciens giúp lá ớt tăng 22,8% chiều dài lá so với đối chứng và có thể sống đến 50 ngày sau khi chủng. Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens
hội đủ những điều kiện của tác nhân kích kháng sinh h c và là tác nhân có triển v ng có thể thương mại hóa (Hu et al., 2010).
Hỗn hợp vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus pumilus cho hiệu
cho cao trong việc kiểm soát bệnh do Sclerotium rolfsii, Ralstonia solanacearum trên cà chua và S. rolfsii, Colletotrichum trên tiêu. Hàm lượng tổng số superoxide dismutase (SOD) và peroxidase (PO) cao hơn 25 – 30% so với đối chứng trước khi xử lí với tác nhân gây bệnh (Jetiyanon, 2007). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Brevibacillus brevis sản sinh nhiều kháng sinh gramicidin S ức chế nhiều
loại nấm bệnh (Murray et al., 1986).
Brevibacillus brevis là một tác nhân kiểm soát sinh h c có tiềm năng trong
thí nghiệm kiểm soát bệnh do F. oxysporum f.sp. lycopersici gây ra trên cà chua
(Chandel et al., 2010).
Brevibacillus brevis có khả năng phân giải chitin và tiết siderophore (Trần
CHƯƠNG 2PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Phương tiện
2.1.1 Thời gian và địa điểm
- Thời gian: từ tháng 5 đến 11/2012
- Địa điểm: tại nhà lưới khoa nông nghiệp ộ môn ảo Vệ Thực Vật (BM.BVTV), khoa Nông Nghiệp và Sinh H c Ứng Dụng, trường Đại H c Cần Thơ.
2.1.2 Vật liệu và thiết bị thí nghiệm
- Nguồn giống: Củ giống gừng Tàu được mua tại trại giống huyện Long Mỹ, tỉnh Hậu Giang.
- Nguồn Xanthomonas sp. được phân lập từ mẫu lá gừng bệnh ruộng gừng đem về (Chợ Mới – An Giang)
- Dụng cụ: ình tam giác, beaker, ống nghiệm, đĩa petri (bán kính = 9,5 cm), ống đong...
- Thiết bị: tủ sấy (Memmert) thanh trùng đĩa, microwave, autoclauve (Hirayama HVE-50), tủ cấy, máy đo pH (Jenway 3150), tủ úm (Memmert E- 700), tủ lạnh trữ mẫu, cân điện tử (Shimadzu UX620H)
- Thuốc hóa h c: LUSATEX 5 SL, AVALON 8 WP, ANTI – XO 200 WP, AGOFAST 80 WP, KASUMIN 2 SL, STEPGUARD 200 TB, STARNER 20 WP
- Hai chủng vi khuẩn vùng rễ Bacillus amyloliquefaciens, Brevibacillus brevis.
Bảng 2.1: Liều lượng các loại thuốc và VKVR sử dụng trong thí nghiệm.
Ghi chú: N1: nồng độ khuyến cáo;
Ghi chú: N1: nồng độ khuyến cáo; N2: nồng độ gấp đôi khuyến cáo.
* Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm - Môi trường King’s B (Schaad, 1988)
Peptrone 20 g K2HPO4 1,5 g MgSO4 1,5 g Agar 20 g Glycerol 15 ml Nước cất 1000ml pH 7 Tên thuốc Nồng độ (%) N1 N2 Lusatex 5SL 0.01 0.02 Avalon 8WP 0.016 0.032 Anti – XO 200WP 0.03 0.06 Agofast 80WP 0.025 0.05 Kasumin 2SL 0.025 0.05 Stepguard 0.01 0.02 Starner 20WP 0.01 0.02
B. amyloliquefaciens 106 cfu 108 cfu
2.2 Phương pháp
2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá gừng do vi khuẩn Xanthomonas sp. của một số loại thuốc hóa học và VKVR trong điều khuẩn Xanthomonas sp. của một số loại thuốc hóa học và VKVR trong điều kiện in vitro
* Mục tiêu: ch n được một số loại thuốc và vi khuẩn vùng rễ có hiệu quả ức chế vi khuẩn Xanthomonas sp.
2.2.1.1 Chuẩn bị
- Môi trường King’s
- Chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. (nhân nuôi trong môi trường King’ lỏng trong 48h trên máy lắc ngang)
- VKVR được nhân nuôi trong môi trường King’s lỏng trong 48 giờ trên máy lắc ngang. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Chuẩn bị các ống nghiệm chứa thuốc pha theo nồng độ với từng nghiệm thức (mỗi ống 10ml).
- Đĩa petri và khoanh giấy thấm được thanh trùng bằng tủ sấy
2.2.1.2 Tiến hành
Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 5 lần lặp lại
Chiết 200 ml môi trường vào các bình tam giác (500 ml) đem thanh trùng autoclave 1210 C trong 20 phút.
Cho bình tam giác có chứa môi trường King’s vào water path để ổn định nhiệt độ (50 – 520C). Cho chủng vi khuẩn Xanthomonas sp. (nhân nuôi 48h trước) với mật số 109
cfu/ml vào bình tam giác có chứa môi trường King’s đã được ổn định nhiệt độ, khuấy đều.
Sử dụng bình tam giác có chứa vi khuẩn Xanthomonas sp. đỗ ra đĩa petri (21 đĩa)
Dùng kẹp (đã hơ trên ng n lửa đèn cồn) gấp giữ các khoanh giấy thấm có tẩm các loại thuốc trong thí nghiệm trên thành ống nghiệm để ráo nước, sau đó đặt khoanh giấy thấm vào đĩa petri (đã có vi khuẩn) gây bệnh thành 5 điểm (đối chứng được đặt trước giữa) lần lượt cho khoanh giấy của 4 nghiệm thức (2 nồng độ của 2 loại thuốc) xếp cách đều đối chứng 2,5 cm trên môi trường. Đĩa thử thuốc được đặt trong tủ úm với nhiệt độ 300C.
2A
1A
2B
1B
Hình 2.1: Sơ đồ thử nghiệm 8 loại thuốc và 2 VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. trong điều kiện phòng thí nghiệm
Ghi chú: ĐC : khoanh giấy thấm nước cất vô trùng 1A, 1B, 2A, 2B : khoanh giấy thấm có tẩm thuốc hoặc VKVR 2.2.1.3 Cách lấy chỉ tiêu
* Các chỉ tiêu theo dõi:
- Đo bán kính vành vô khuẩn vi khuẩn bị ức chế
+ Cách lấy chỉ tiêu: Đo khoảng cách từ tâm khoanh giấy thấm thuốc đến vị trí khuẩn lạc vi khuẩn bị ức chế tại thời điểm theo dõi.
+ Thời gian lấy chỉ tiêu lúc 12h, 24h, 48h, 72h và 96h sau khi xử lý.
+ Bán kính vành vô khuẩn được đánh giá theo thang đáng giá của Jackson et al. (1991).
1: đối kháng phát triển phủ trên mầm bệnh và mầm bệnh ngừng phát triển. 2: Mầm bệnh phát triển vượt trội đối kháng và đối kháng bị dừng lại. 3: Ức chế lẫn nhau với vùng ức chế 1-3 mm.
4: Ức chế mạnh >4 mm.
2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả phòng trị bệnh cháy bìa lá gừng do
Xanthomonas sp. của một số loại thuốc hóa học và 2 vi khuẩn vùng rễ trong điều kiện ngoài nhà lưới
* Mục tiêu: Xác định loại thuốc có hiệu quả trong phòng trị bệnh cháy bìa lá gừng trong điều kiện nhà lưới.
2.2.2.1 Chuẩn bị
- Chuẩn bị môi trường King’s .
ĐC
- Trồng cây gừng được 2,5 tháng tuổi.
- a loại thuốc hóa h c có hiệu quả ức chế nấm nhất và 2 chủng Bacillus. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.2 Tiến hành
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại, 6 nghiệm thức (3 loại thuốc 2 loại vi khuẩn và 1 đối chứng).
* Cách thực hiện:
- Ủ hom gừng: Dùng tay bẻ các đoạn củ có chứa khoảng 2 mắt mầm sau đó khử trùng bằng Ca(OCl)2 1% trong 15 phút, vớt ra để ráo. Ủ hom gừng giống nơi có bóng râm, xếp ủ trên nền cao ráo, thoát nước tốt và được phủ lên trên một lớp tro trấu. Tưới nước vừa đủ ẩm giúp hom nẩy mầm.
- Chuẩn bị đất trồng:
Trộn hổn hợp đất trồng với tỉ lệ 2 đất : 1 phân chuồng hoai : 1 rơm hoai mục.
Đục lổ nhỏ dưới đáy bao để thoát nước sau đó cho hổn hợp đất trồng đã trộn đều vào bao với độ dày khoảng 40 cm.
Xử lý đất bằng Ca(OCl)2 5% có phủ nilon kín trong 15 ngày trước khi trồng.
- Tiến hành trồng và chăm sóc:
Bảng 2.2: Liều lượng các loại thuốc sử dụng trong thí nghiệm
STT Tên thuốc Nồng độ khuyến
cáo(%) 1 Starner 20WP 0,125 2 Avalon 200 0,0875 3 Stepguard 200 TB 0,1 4 B. amyloquefaciens Huyền phù 108 bào tử/ml
5 Brevibacillus brevis Huyền phù 108
bào tử/ml
Gừng được trồng trong bao (kích thước 35x35 cm chứa khoảng 11 kg đất/bao) với số lượng 3 cây/ bao, trong điều kiện nhà lưới và được bón phân với liều lượng: NPK 20-20-15, liều lượng 1,3g/bao/lần bón - 2 tuần.
Chăm sóc khác: Tưới nước, nhổ cỏ và vô thêm đất cho cây.
2.2.2.3 Cách lấy chỉ tiêu
Lấy chỉ tiêu 5 cây/b c (bao) và được làm dấu để lấy cố định.
Đo chiều cao cây các thời điểm trước xử lý. 3, 5, 7 ngày sau xử lý lần 1, 14 và 21ngày sau xử lý lần 2.
* Đánh giá bệnh
Trên mỗi cây đo chiều cao cây và chiều dài vết bệnh các thời điểm trước, 3, 5 và 7 ngày sau xử lý lần 1, 14 và 21 ngày sau xử lý lần 2. Từ đó, ta tính được tỷ lệ (%) diện tích cây nhiễm bệnh theo công thức của Gnanamanickam et al.,
(1999) như sau:
TLB(%) = DVB / DL x 100
Trong đó: * TL : tỷ lệ nhiễm bệnh. * DL: chiều cao cây. * DV : chiều dài vết bệnh.
- Từ tỷ lệ diện tích cây nhiễm bệnh, tính hiệu quả giảm bệnh theo công thức HQG (%) = [(TL iđc – TL i)] / TL đc x 100
* TL iđc: tỷ lệ nhiễm bệnh trung bình đối chứng lần lặp lại thứ i (%) * TL i: tỷ lệ nhiễm bệnh lần lặp lại thứ i (%)
- Kết thúc lấy chỉ tiêu khi đối chứng chết hoàn toàn.
2.3 Xử lý số liệu
Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý sơ bộ (chuyển đổi số liệu, tính trung bình,...), bằng chương trình Microsoft Excel 2003. Các phân tích thống kê như phân tích phương sai (Analysis of Variance), so sánh, kiểm định sự khác biệt P = 0,05 giữa các trung bình nghiệm thức, trung bình các nhân tố được tính theo phép thử Duncan (Duncan’s Multiple Range Test) nhờ vào chương trình MSTAT-C.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
GHI NHẬN TỔNG QUÁT
Nhiệt độ cao và mưa nhiều có ảnh hư ng đến mức độ gây hại của bệnh. Với từng loại thuốc và từng chủng VKVR khác nhau mà có khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty của nấm cũng khác nhau.
3.1 Đánh giá khả năng đối kháng của một số loại thuốc hóa học và vi khuẩn vùng rễ đối với Xanthomonas sp. trong điều kiện in vitro. vùng rễ đối với Xanthomonas sp. trong điều kiện in vitro.
Hiệu quả của thuốc và VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. được đánh giá thông qua bán kính vành vô khuẩn với vi khuẩn Xanthomonas sp..
Hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh của 7 loại thuốc hóa h c và 2 VKVR bắt đầu thể hiện từ thời điểm 12 giờ sau thí nghiệm.
3.1.1 Thời điểm 12 giờ sau thí nghiệm (12GSTN)
* Bán kính vòng vô khuẩn
Kết quả từ ảng 3.1 cho thấy, nghiệm thức xử lý với STEPGUARD 200 TB (Streptomycin sulphate) tạo ra bán kính vòng vô khuẩn lớn nhất (1,095 cm) khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Kế đến STARNER 20 WP (Oxolinic acid 20%), AVALON 8 WP (Oxytetracycline Hydrochloride 6% và Gentamicine Sulfate 2%) cũng có bán kính vòng vô khuẩn lớn lần lượt là: 0,975 cm và 0,498 cm khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Các nghiệm thức còn lại gồm LUSATEX 5 SL (Ningnanmycin 10%), ANTI – XO 200 WP (Bismerthiazol), AGOFAST 80WP (Aluminium tris (O-ethyl phosphonate)), KASUMIN 2SL ([5- Amino- 2- metyl- 6- (2, 3, 4, 5, 6- pentahidroxi- clohexyloxi) tetrahidropyran- 3- yl] amino—iminoaxetic axit), đều không tạo bán kính vòng vô khuẩn và khác biệt không có ý nghĩa với nhau và nghiệm thức đối chứng.
Vi khuẩn Brevibacillus brevis và B. amyloliquefaciens có bán kính vòng vô khuẩn lần lượt là 0,333 cm và 0,403 cm khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng.
Ở 2 nồng độ thì bán kính vòng vô khuẩn khác biệt không có ý nghĩa các nghiệm thức. Tuy nhiên, đối với nghiệm thức Avalon 8 WP và B. amyloliquefaciens thì 2 nồng độ bán kính vòng vô khuẩn khác biệt có ý nghĩa.
Trong đó, nồng độ N1 thì Stepguard 200TB có bán kính vòng vô khuẩn lớn nhất (1,095 cm) trong các nghiệm thức và khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm
thức còn lại. Starner 20WP có bán kính vòng vô khuẩn lớn thứ hai (0,960 cm) cũng khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại. Riêng Avalon 8 WP có bán kính vòng vô khuẩn là 0,410 cm, khac biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức còn lại (trừ 2 nghiệm thức B. amyloliquefaciens và Brevi bacillusbrevis). Còn
nồng độ N2 thì bán kính vòng vô khuẩn của Stepguard 200TB, Starner 20WP, Avalon 8WP lần lượt là 1,095 cm, 0,990 cm, 0,585 cm khác biệt có ý nghĩa so với nhau và các loại thuốc còn lại.
Vi khuẩn Brevibacillus brevis có bán kính vòng vô khuẩn 2 nồng độ
khác biệt không có ý nghĩa so với nhau nhưng khác biệt có ý nghĩa so với đối chứng. Còn vi khuẩn B. amyloliquefaciens có bán kính vòng vô khuẩn 2 nồng độ khác biệt có ý nghĩa so với nhau và so với đối chứng.
ảng 3.1: án kính vòng vô khuẩn của các loại thuốc và VKVR đối với vi khuẩn Xanthomonas sp. thời điểm 12GSTN
Loại thuốc (A) án kính các nồng độ xử lý
LUSATEX N1 0,00 F N2 0,00 F AVALON N1 0,41 DE N2 0,59 C STARNER N1 0,96 B N2 0,99 B ANTI – XO N1 0,00 F N2 0,00 F ANGOFAST N1 0,00 F N2 0,00 F KASUMIN N1 0,00 F N2 0,00 F STEPGUARD N1 1,10 A N2 1,10 A B. amyloliquefaciens 10 6 0,48 D 108 0,33 E Brevibacillus brevis 10