2.4.1. Xác định vật chất khô (DM)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Cân trọng lượng mẫu bằng cân phân tích trước và sau khi sấy khô ở 105oC trong 48 giờ. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 2000).
2.4.2. Phương pháp phân tích xơ thô (Crude Fiber-CF)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan, pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường acid H2SO4 1,25%.
của tế bào thực vật bao gồm: cellulose, hemicelluloses, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng. (AOAC, 1993).
2.4.3. Khảo sát đường khử bằng phương pháp Nelson Soymogi
Nguyên tắc: Thí nghiệm dựa trên phản ứng của các nhóm đường khử với dung dịch Nelson (Nelson, 2003)
khử sẽ phản ứng với dung dịch đồng và chuyển sang màu nâu đỏ Đường khi bị đun nóng. Khi Aseno Moblydate được thêm vào hỗn hợp, dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh và hấp thu bước sóng 520nM.
2.4.4. Phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc: Protein là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ với cấu trúc phức tạp. Trong thành phần hóa học của protein chứa: carbon (50 – 55 %), oxy (22 – 26%), nitơ (12 – 19 %), hydro (6 – 8%) và lưu huỳnh (0 – 2 %).
Bằng phương pháp kjeldahl có thể sát định hàm lượng nitơ tổng số. Phương pháp này được kjeldahl phát triển vào năm 1883, dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và các chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O, nitơ chuyển thành ammoniac (NH3) và tiếp tục phản ứng với H2SO4 để tạo thành muối ammonium sulfate. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu:
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Trong quá trình chưng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dư thừa và giải phóngNH3:
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3
Ammoniac sinh ra sẽ được hấp thu bằng dung dịch acid Boric có chứa chất chỉ thị tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch này bằng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N; NH3 được giải phóng và sátđịnh được lượng nitơ, theo các phản ứng sau:
2NH4OH + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4 H3BO3
2.4.5. Phương pháp chuẩn độ đạm ammoniac
thường tồn tại dưới dạng muối amon. Đểđịnh lượng ammoniac thì cần phải đẩy muối amon ra thể tự do (dưới tác dụng muối NH4Cl) bằng một chất kiềm mạnh hơn ammoniac như Mg(OH)2. Dung dịch nước kéo ammoniac đã được giải phóng sang bình hấp thụ chứa dung dịch acid boric (H3BO3) với chất chỉ thị màu (hỗn hợp bromoresol green và methyl red) tạo thành muối amon tetraborate.
2NH4Cl + Mg(OH)2 → MgCl2 + 2NH3 + H2O 2NH3 + 4H3BO4 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
Sau đó định phân lượng nitơ trong dung dịch (NH4)2B4O7 bằng dung dịch acid mạnh H2SO4 0,05N (chuẩn) đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang đỏ nâu.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3
2.4.6. Phương pháp đếm mật số vi sinh bằng buồng đếm hồng cầu
Đây là phương pháp định lượng số tế bào nấm men dựa trên sự quan sát và đếmtrực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng kính hiển vi và buồng đếm.
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nước ta có thể nói được bắt đầu từ năm 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh lực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đường và sản xuất chế phẩm sinh học.
Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đường hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹthuật Sinh học thuộc Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase được tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae
làm cho nó có hai đặc tính đường hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn.
Hiện nay các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phấm sinh học bổ sung vào khẩu phần ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trưng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ít như
BacillusSpp., LactobacillusSpp.,SaccharomycesSpp., (Vương Thị Hồng Vi, 2007).
Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả (bã khóm) làm thức ăn chăn nuôi.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Đã có nhiều nghiên cứu trước hết về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của một số giống nấm men được sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào như Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Cainsnorth, G. et al., 1962).
Những nghiên cứu đầu tiên về sinh vật học trong bánh men rượu nước ta được thực hiên vào cuối thế kỷ 19 bởi Calmettencuar vào năm 1948.
Các nhà khoa học trên thế giới đang hướng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trường xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột như sắn và các sản phẩm nông nghiệp như bã dừa, vỏ chuối, bã mía,…(Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trước đây người ta sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và một số vi khuẩn lactic (Nguyễn khắc Tuấn, 1996).
Mahnaaz Khan et al., (2012) nghiên cứu để sản xuất protein đơn bào từ saccharomyces trên nguồn cơ chất là chất thải trái cây.
Tuntptachalern, S. (1978) nghiên cứu sản xuất protein đơn bào từ nấm men
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm công nghệ enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014
3.1.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incubell 111 (Đức), kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái Lan), tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam)
3.1.3. Dụng cụ
Eppendoft 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500ml, đĩa petri đường kính 10cm (Đức), ống nghiệm 10ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
3.1.4. Hóa chất
Ethanol 96%, agar, D-Glucose, CaSO4, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, sodium hydroxide (NaOH), K2Cr2O7, Na2S2O3, H2SO4, KI,…
3.1.5. Nguyên vật liệu
Dòng nấm men H13đồng hình với Saccharomyces cerevisiaeở mức 94%, được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme bộ môn Công Nghệ Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.6. Môi trường nuôi cấy nấm men
Bảng 2: Thành phần môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1)
Tên hóa chất Khối lượng (g)/Thể tích (ml)
Khoai tây 20 (ml)
D-glucose 20 (g)
Agar 20 (g)
Nước cất 1000 (ml)
(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003)
Bảng 3: Thành phần môi trường M2
Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)
K2HPO4 1 (g) (NH4)2SO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Bã mía 10 (g) Agar 20 (g) Nước cất 1000 (ml)
(*Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010)
Bảng 4: Thành phần môi trường M3
Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)
Bột bã vỏ khóm 10 (g) (NH4)2SO4 1 (g) KH2PO4 1 (g) K2HPO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Nước cất 1000 (ml)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Khảo sát thành phần hóa học của bã vỏ khóm
Vỏ khóm sau khi thu về, rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô 60oC, xay nhỏ bằng máy nghiền mẫu Retch :
Phần 1: sấy khô ở 45 – 50oC, khoảng 2 giờ. Nghiền bột bằng máy nghiền mẫu Retch với kích thước lưới 0,12 mm.
Phần 2:rửa sạch bã để loài đường. Phơi khô, sấy ở 45 – 50oC khoảng 24 giờ. Nghiền bột bằng máy nghiền mẫu Retch với kích thước lưới 0,12mm.
Khảo sát một số chỉ tiêu - Phần trăm vật chất khô (DM) - Hàm lượng đạm tổng
- Hàm lượng đường khử - Hàm lượng xơ thô (CF)
3.2.2. Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm:Xác định thành phần môi trường (cách xử lý cơ chất) thích hợp cho sự tăng trưởng nhanh và phân giải bã khóm hiệu quả của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại; 2 nghiệm thức tương ứng với 2 loại mẫu bột bã vỏ khóm được xử lý khác nhau;nghiệm thức đối chứng không có bổ sung nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng 10% dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml vào 45 ml môi trường M3 tương ứng với từng nghiệm thức. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút trong 3 ngày,ở 38oC).
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô (DM)
3.2.3. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dịch tế bào nấm men đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. 5 nghiệm thức tương ứng 5 tỷ lệ dịch tế bào nấm men (1%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10% v/v). Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ theo từng nghiệm thức vào môi trường M3 ở thí nghiệm 1. Ủ mẫu (lắc ngang, 40vòng/phút trong 3 ngày,ở 38oC).
Chỉ tiêu theo dõi:
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Sát định đạm ammoniac
3.2.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện pH đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men bã vỏ khóm của nấm men
Mục đíchthí nghiệm: Xác định pH thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lai. 6 nghiệm thức pH (3, 4, 5, 6, 7, 8). Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ tối ưu đã xác định trong thí nghiệm 2 vào môi trường M3 đã chuẩn pH tương đương với từng nghiệm thức. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút trong 3 ngày,ở 38oC).
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô (DM)
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Hàm lượng ammoniac
3.2.5. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngãu nhiên, 3 lần lặp lại. 5 nghiệm thức nhiệt độ (30, 35, 38, 40, 45). Nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men: Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trườn M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ thích hợp đã sát định ở thí nghiệm 2 vào môi trường M3 được chuẩn pH thích hợp được xác định trong thí nghiệm 3. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút3 ngày, ở nhiệt độ của từng nghiệm thức).
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Hàm lượng ammoniac
3.2.6.Thí nghiệm 5: đánh giá ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian ủ thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. 10 nghiệm thức thời gian (1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày). Nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành thí nghiệm
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M3 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỉ lệ thích hợp được xác định ở thí nghiệm 2 vào môi trường đã được chuẩn pH thích hợp được xác định ở thí nghiệm 3. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút ở nhiệt độ thích hợp ở thí nghiệm 4). Lần lượt thu mẫu theo thời gian ủ của từng nghiêm thức.
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô (DM)
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Hàm lượng ammoniac
3.3. Phương pháp phân tích kết quả thí nghiệm
Số liệu được xử lý bằng bảng tính Microsoft Excel 2007 và phân tích thống kê trên phần mềm Stagraphic XV.
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thành phần nguyên liệu
Bảng 5. Hàm lượng các thành phần hóa học trong bã vỏ khóm Thành phần khảo sát Hàm lượng vật chất khô (%) Hàm lượng Xơ thô (%) Hàm lượng đam tổng (%) Nồng độ đường khử (µg/ml) BK+ 91,36 ± 1,22 15,4 ± 0,15 3,93 ± 0,03 12,48 ± 0,08 BK- 92,78 ± 1,26 41,8 ± 0,69 1,44 ± 0,01 0,7 ± 0,18
* BK : bã khóm không rửa; BK-: bã khóm rửa loại đường và các chất hòa tan khác.
Hàm lượng vật chất khô sau khi sấy đến trọng lượng không đổi ở 70oC trong 48h của bã khóm không rửa đạt 91,36% thấp hơn hàm lượng vật chất khô của bã vỏ khóm rửa 92,78%. Khi để ngoài môi trưởng bên ngoài bã khóm không rửa hấp thu ẩm nhiều hơn so với bã mía rửa loại bỏ các thành phần hòa tan. Các chất hòa tan đã hấp thu ẩm độ mạnh. Theo Theo Rani et al., (2004), hàm lượng vật chất khô bã khóm là 95,9%. Kết quả khảo sát khác nhau là do nơi luu trữ mẫu có ẩm độ khác nhau
Hàm lượng xơ thô là kết quả của việc phân tích hàm lượng xơ thô bằng máy phân tich xơ, sử dung H2SO4, NaOH để loại bỏ các chất non-cellulose. Kết quả bã khóm không rửa 15,4% xơ. Kết quả này thấp hơn so vơi María Elena Sánchez Pardo et al., 2014 đã khảo sát 20% chất xơ sau khi loại bỏ các phần ăn được. kết quả phân tích có sự khác biệt là do khi thu mẫu bã khóm, thu cả phần thịt khóm ít hàm lượng xơ ít hơn so với vỏ khóm. Bã khóm rửa (41,8% xơ), do loại bỏ những chất hòa tan nên thành phân xơ tăng lên so với bã vỏ khóm không rửa (26,4%).
Hàm lượng đạm tổng là xác định hàm lượng Nitơ tổng (tất các các dạng của Nitơ trong nguyên liệu). Bã mía rửa đã loại đi những chất chứa đạm như protein nên hàm lượng đạm đã giảm đi. Bã vỏ khóm không rửa có protein tổng là 3,93%, kết quả này cao hơn so với kết quả của María Elena Sánchez Pardo et al., 2014 đã khảo sát proten tổng là 1,58%. Theo Rani et al., (2004) protein tổng 3,3%. Sự khác biệt làdo trong qua trình thu mẫu, lượng phần thịt khóm trong vỏ khóm khá nhiều, giàu potein. Bã khóm rửa (1,44%) đã loại đi thành phần protein trong mẫu nên hàm lượng protein tổng giảm so với bã khóm không rửa (2,49%).
Hàm lượng đường khử của bã vỏ khóm không rửa là 24,96%. Bã vỏ khóm thành phần đường khá cao, chủ yếu là đường xylose và đường Glucose, (Larraur et al., 1997). Kết quả này tháp hơn so với kết quả khảo sát của Rani et al., (2004)bã khóm có lượng đường khử là 27,8%. Hàm lượng đường khử của bã vỏ khóm rửa là 0,7 µg/ml, do khi rửa đã loại bỏ phần lớn lượng đường, so với bã vỏ khóm không rửa 12,48 µg/ml.
4.2. Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất đến khả năng phân giải bã vỏ khóm của nấm men khóm của nấm men
Hình 4.1. Ảnh hưởng của phương pháp xử lý cơ chất đến khả năng tăng trưởng của nấm men
* BK: Bã khóm không rửa; BK-: bã khóm rửa.
* Các giá trị là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có cùng ký tự thể hiện sự khác