2.3.1. Hệ enzyme thủy phân cellulose
Cellulase là phức hệ enzyme thủy phân cellulose tạo thành các phân tử đường β-glucose . Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, cellulose bị phân giải dưới tác dụng hiệp đồng của phức hệ cellulase bao gồm 3 enzyme Exo- β(1,4)-glucanase hay enzyme C1, Endo-β-glucanase hay endocellulase còn gọi là enzyme CMC-ase hay Cx và β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase:
- Exo-β(1,4)-glucananse giải phóng cellobiose hay glucose từ đầu không khử của cellulose, tác dụng yếu lên CMC nhưng tác dụng mạnh lên cellulose vô định hình hay cellulose đã bị phân giải một phần. Tác dụng lên cellulose kết tinh không rõ nhưng khi có mặt endoglucanase thì có tác dụng hiệp đồng rõ rệt.
- Endo-β-glucanase thủy phân liên kết β-1,4-glucoside và tác động vào chuỗi cellulose một cách tùy tiện, sản phẩm của quá trình thủy phân là cellobiose và glucose. Do thủy phân CMC hoặc cellulose theo kiểu tùy tiện nên endo-β- glucanase làm giảm nhanh chiều dài của chuỗi cellulose và tăng chậm các nhóm khử, enzyme tác động mạnh lên cellodextrin. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình của cellulose nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose.
- β-(1,4)-glucosidase hay cellobiase thủy phân các cellobiose và các cellodextrin khác hòa tan trong nước sinh ra, chúng có hoạt tính cao trên cellobiose, còn cellodextrin thì hoạt động thấp và giảm khi chiều dài của chuỗi tăng lên. Chức năng của β-(1,4)-glucosidase hay cellobioase có thể là điều chỉnh sự tích lũy của các chất cảm ứng của cellulase.
2.3.2. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase
Cellulase là một hệ enzyme phức tạp xúc tác sự thủy phân cellulose thành cellobiose và cuối cùng là glucose.
Sự phân giải cellulose dưới tác dụng của enzyme cellulase xảy ra theo ba giai đoạn chủ yếu sau:
Trong giai đoạn thứ nhất dưới tác dụng của tác nhân C1, cellulose bị thủy phân thành cellusoe sợi đơn. Trong giai đoan thứ hai cellulose sợi đơn sẽ bị thủy phân dưới tác dụng xúc tác của hệ enzyme Cx tạo thành đường cellobiose.
Ở giai đoạn cuối cùng, dưới tác dụng của enzyme β-(1,4)-glucosidase hay cellobiase, cellobiose bị thủy phân thành glucose
Hình 2.4: Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase
(*nguồn:http://i.imgur.com/mz7as.jpg, ngày 21/6/14)
2.3.3 Hệ enzym thủy phân hemicellulose
Do tính không đồng nhất của hemicellulose, sự thủy phân của nó đòi hỏi nhiều ảnh hưởng của một hệ thống enzyme phức tạp. Enzyme này thường bao gồm hai loại: enzyme không phân nhánh (β-1,4-endohemicellulosese, β- xylosidase) và enzyme phân nhánh (α-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, esterase hemicellulose acetyl và esterase acid phenolic). Tất cả các enzyme này
tác động tương hỗ để chuyển đổi hemicellulose thành cấu tử đường của nó (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
β-D-xylosidase
β-D-xylosidase (β-D-xyloside xylohydrolase – EC 3.2.1.37) là enzyme thủy phân các xylooligosaccharide ngắn và xylobiose thành đường xylose. Ái lực của enzyme đối với xyloligosaccharide giảm theo mức độ tăng của phản ứng polyme hóa. Hầu hết các β-xylosidase đều bị ức chế bởi xylose.Nhiều β-xylosidase có hoạt tính transferase, đặc biệt là ở các nồng độ cơ chất cao, tạo ra sản phẩm phân tử lượng cao.
α-L-arabinofuranosidase
Arabinosidase đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân hemicellulose. Có hai loại enzyme arabinase: các enzyme α-L- arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) phân cắt các p-nitrophenly-α-L- arabinofuranoside trên các arabinan phân nhánh và các enzyme 1,5-α-L- arabinase (EC 3.2.1.99) chỉ cắt arabinan dạng thẳng.
α-glucuronidase
α-D-glucuronidase phân giải liên kết α-1,2 giữa acid glucuronic và gốc xylose trong phân tử glucuronohemicellulose. Tính đặc hiệu của α-glucuronidase khác nhau phụ thuộc vào nguồn gốc của enzyme.
Acetylhemicellulose Esterase Esterase acetylhemicellulose là enzyme có thể cắt đứt giữa các nhóm acetyl với hai hoặc ba vị trí của gốc xylose và góp phần đóng vai trò thủy phân hemicellulose trong tự nhiên.
2.4. Một số phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Xác định vật chất khô (DM) 2.4.1. Xác định vật chất khô (DM)
Nguyên tắc: Dùng nhiệt làm bay hơi nước có trong nguyên liệu. Cân trọng lượng mẫu bằng cân phân tích trước và sau khi sấy khô ở 105oC trong 48 giờ. Phần còn lại là vật chất khô của nguyên liệu (AOAC, 2000).
2.4.2. Phương pháp phân tích xơ thô (Crude Fiber-CF)
Nguyên tắc: Phương pháp dựa vào sự hòa tan, pectin, phần lớn protein, lipids, các khoáng hòa tan, một số silica trong môi trường acid H2SO4 1,25%.
của tế bào thực vật bao gồm: cellulose, hemicelluloses, lignin, cutin, khoáng không tan và protein màng. (AOAC, 1993).
2.4.3. Khảo sát đường khử bằng phương pháp Nelson Soymogi
Nguyên tắc: Thí nghiệm dựa trên phản ứng của các nhóm đường khử với dung dịch Nelson (Nelson, 2003)
khử sẽ phản ứng với dung dịch đồng và chuyển sang màu nâu đỏ Đường khi bị đun nóng. Khi Aseno Moblydate được thêm vào hỗn hợp, dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh và hấp thu bước sóng 520nM.
2.4.4. Phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc: Protein là một hợp chất hữu cơ chứa nitơ với cấu trúc phức tạp. Trong thành phần hóa học của protein chứa: carbon (50 – 55 %), oxy (22 – 26%), nitơ (12 – 19 %), hydro (6 – 8%) và lưu huỳnh (0 – 2 %).
Bằng phương pháp kjeldahl có thể sát định hàm lượng nitơ tổng số. Phương pháp này được kjeldahl phát triển vào năm 1883, dưới tác dụng của H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và các chất xúc tác, các hợp chất hữu cơ có chứa nitơ bị phân hủy và bị oxy hóa đến CO2 và H2O, nitơ chuyển thành ammoniac (NH3) và tiếp tục phản ứng với H2SO4 để tạo thành muối ammonium sulfate. Đây là giai đoạn công phá đạm trong mẫu:
2NH3 + H2SO4 → (NH4)2SO4
Trong quá trình chưng cất, (NH4)2SO4 tác dụng với NaOH dư thừa và giải phóngNH3:
(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3
Ammoniac sinh ra sẽ được hấp thu bằng dung dịch acid Boric có chứa chất chỉ thị tạo thành tetraborat amon. Sau đó chuẩn độ dung dịch này bằng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N; NH3 được giải phóng và sátđịnh được lượng nitơ, theo các phản ứng sau:
2NH4OH + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O (NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4 H3BO3
2.4.5. Phương pháp chuẩn độ đạm ammoniac
thường tồn tại dưới dạng muối amon. Đểđịnh lượng ammoniac thì cần phải đẩy muối amon ra thể tự do (dưới tác dụng muối NH4Cl) bằng một chất kiềm mạnh hơn ammoniac như Mg(OH)2. Dung dịch nước kéo ammoniac đã được giải phóng sang bình hấp thụ chứa dung dịch acid boric (H3BO3) với chất chỉ thị màu (hỗn hợp bromoresol green và methyl red) tạo thành muối amon tetraborate.
2NH4Cl + Mg(OH)2 → MgCl2 + 2NH3 + H2O 2NH3 + 4H3BO4 → (NH4)2B4O7 + 5H2O
Sau đó định phân lượng nitơ trong dung dịch (NH4)2B4O7 bằng dung dịch acid mạnh H2SO4 0,05N (chuẩn) đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang đỏ nâu.
(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5H2O → (NH4)2SO4 + 4H3BO3
2.4.6. Phương pháp đếm mật số vi sinh bằng buồng đếm hồng cầu
Đây là phương pháp định lượng số tế bào nấm men dựa trên sự quan sát và đếmtrực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng kính hiển vi và buồng đếm.
2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Công tác nghiên cứu và ứng dụng nấm men trong chăn nuôi ở nước ta có thể nói được bắt đầu từ năm 1960 trở lại đây. Bao gồm các lĩnh lực sản xuất sinh khối tế bào, lên men thức ăn bột đường và sản xuất chế phẩm sinh học.
Để tạo ra giống nấm men vừa có khả năng đường hóa cao vừa có khả năng tạo sinh khối lớn, Viện Kỹthuật Sinh học thuộc Trung tâm Khoa học và Công nghệ Quốc gia Việt Nam đã nghiên cứu cấy chuyển gen amylase được tách từ chủng Endomycopsis fibuligera và gây biến nạp cho Saccharomyces cerevisiae
làm cho nó có hai đặc tính đường hóa cao và sinh tổng hợp protein cao dùng trong chế biến thức ăn.
Hiện nay các nhà chăn nuôi khá quan tâm đến việc sử dụng chế phấm sinh học bổ sung vào khẩu phần ăn cho gia súc, gia cầm. Đặc trưng của các chế phẩm sinh học này là sự kết hợp của nhiều chủng loại vi sinh vật có ít như
BacillusSpp., LactobacillusSpp.,SaccharomycesSpp., (Vương Thị Hồng Vi, 2007).
Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả (bã khóm) làm thức ăn chăn nuôi.
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Đã có nhiều nghiên cứu trước hết về bản chất sinh học, khả năng sinh hóa, phân loại của một số giống nấm men được sử dụng phổ biến trong sản xuất sinh khối tế bào như Saccharomyces, Torulopsis và Candida (Cainsnorth, G. et al., 1962).
Những nghiên cứu đầu tiên về sinh vật học trong bánh men rượu nước ta được thực hiên vào cuối thế kỷ 19 bởi Calmettencuar vào năm 1948.
Các nhà khoa học trên thế giới đang hướng đến nghiên cứu chọn giống cho quá trình nâng cao công nghệ lên men truyền thống trên môi trường xốp để làm giàu protein cho các sản phẩm giàu tinh bột như sắn và các sản phẩm nông nghiệp như bã dừa, vỏ chuối, bã mía,…(Nguyễn Khắc Tuấn, 1996). Trước đây người ta sử dụng nấm sợi để lên men song do vấn đề sinh độc tố mycotoxin làm các nhà chăn nuôi e ngại. Do đó, họ chú ý đến nấm men và một số vi khuẩn lactic (Nguyễn khắc Tuấn, 1996).
Mahnaaz Khan et al., (2012) nghiên cứu để sản xuất protein đơn bào từ saccharomyces trên nguồn cơ chất là chất thải trái cây.
Tuntptachalern, S. (1978) nghiên cứu sản xuất protein đơn bào từ nấm men
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: phòng thí nghiệm công nghệ enzyme, Viện Nghiên Cứu Và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường Đại Học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện đề tài: Từ tháng 08/2014 đến tháng 12/2014
3.1.2. Thiết bị
Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incubell 111 (Đức), kính hiển vi Olympus CHT (Nhật), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái Lan), tủ lạnh -40C Akira (Việt Nam)
3.1.3. Dụng cụ
Eppendoft 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, ống nghiệm, bình Erlenmeyer 500ml, đĩa petri đường kính 10cm (Đức), ống nghiệm 10ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: que cấy, que thủy tinh, bình tam giác, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, ống đong, đèn cồn,…
3.1.4. Hóa chất
Ethanol 96%, agar, D-Glucose, CaSO4, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, sodium hydroxide (NaOH), K2Cr2O7, Na2S2O3, H2SO4, KI,…
3.1.5. Nguyên vật liệu
Dòng nấm men H13đồng hình với Saccharomyces cerevisiaeở mức 94%, được lưu trữ tại phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme bộ môn Công Nghệ Sinh Học Phân Tử, Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.6. Môi trường nuôi cấy nấm men
Bảng 2: Thành phần môi trường Potatose Glucose Agar (PGA) (M1)
Tên hóa chất Khối lượng (g)/Thể tích (ml)
Khoai tây 20 (ml)
D-glucose 20 (g)
Agar 20 (g)
Nước cất 1000 (ml)
(*Nguồn: Nguyễn Lân Dũng, 2003)
Bảng 3: Thành phần môi trường M2
Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)
K2HPO4 1 (g) (NH4)2SO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Bã mía 10 (g) Agar 20 (g) Nước cất 1000 (ml)
(*Nguồn: Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010)
Bảng 4: Thành phần môi trường M3
Tên hóa chất Khối lượng (g)/ Thể tích (ml)
Bột bã vỏ khóm 10 (g) (NH4)2SO4 1 (g) KH2PO4 1 (g) K2HPO4 1 (g) MgSO4.7H2O 0,5 (g) NaCl 0,001 (g) Nước cất 1000 (ml)
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Khảo sát thành phần hóa học của bã vỏ khóm
Vỏ khóm sau khi thu về, rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô 60oC, xay nhỏ bằng máy nghiền mẫu Retch :
Phần 1: sấy khô ở 45 – 50oC, khoảng 2 giờ. Nghiền bột bằng máy nghiền mẫu Retch với kích thước lưới 0,12 mm.
Phần 2:rửa sạch bã để loài đường. Phơi khô, sấy ở 45 – 50oC khoảng 24 giờ. Nghiền bột bằng máy nghiền mẫu Retch với kích thước lưới 0,12mm.
Khảo sát một số chỉ tiêu - Phần trăm vật chất khô (DM) - Hàm lượng đạm tổng
- Hàm lượng đường khử - Hàm lượng xơ thô (CF)
3.2.2. Thí nghiệm 1: Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý cơ chất đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm:Xác định thành phần môi trường (cách xử lý cơ chất) thích hợp cho sự tăng trưởng nhanh và phân giải bã khóm hiệu quả của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại; 2 nghiệm thức tương ứng với 2 loại mẫu bột bã vỏ khóm được xử lý khác nhau;nghiệm thức đối chứng không có bổ sung nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng 10% dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml vào 45 ml môi trường M3 tương ứng với từng nghiệm thức. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút trong 3 ngày,ở 38oC).
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô (DM)
3.2.3. Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của tỷ lệ dịch tế bào nấm men đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ nấm men thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. 5 nghiệm thức tương ứng 5 tỷ lệ dịch tế bào nấm men (1%, 2,5%, 5%, 7,5%, 10% v/v). Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ theo từng nghiệm thức vào môi trường M3 ở thí nghiệm 1. Ủ mẫu (lắc ngang, 40vòng/phút trong 3 ngày,ở 38oC).
Chỉ tiêu theo dõi:
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Sát định đạm ammoniac
3.2.4. Thí nghiệm 3: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện pH đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men bã vỏ khóm của nấm men
Mục đíchthí nghiệm: Xác định pH thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lai. 6 nghiệm thức pH (3, 4, 5, 6, 7, 8). Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ tối ưu đã xác định trong thí nghiệm 2 vào môi trường M3 đã chuẩn pH tương đương với từng nghiệm thức. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút trong 3 ngày,ở 38oC).
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô (DM)
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Hàm lượng ammoniac
3.2.5. Thí nghiệm 4: Đánh giá ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngãu nhiên, 3 lần lặp lại. 5 nghiệm thức nhiệt độ (30, 35, 38, 40, 45). Nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành thí nghiệm:
- Nấm men: Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trườn M2 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỷ lệ thích hợp đã sát định ở thí nghiệm 2 vào môi trường M3 được chuẩn pH thích hợp được xác định trong thí nghiệm 3. Ủ mẫu (lắc ngang, 40 vòng/phút3 ngày, ở nhiệt độ của từng nghiệm thức).
Chỉ tiêu theo dõi
- Mật số nấm men
- Hàm lượng vật chất khô
- Phần trăm xơ thô (CF) được phân giải - Hàm lượng ammoniac
3.2.6.Thí nghiệm 5: đánh giá ảnh hưởng của thời gian ủ đến sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian ủ thích hợp cho sự phân giải bã vỏ khóm của nấm men.
Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. 10 nghiệm thức thời gian (1 ngày, 2 ngày, 3 ngày, 4 ngày, 5 ngày). Nghiệm thức đối chứng không chủng nấm men.
Tiến hành thí nghiệm
- Nấm men được nuôi tăng sinh trong môi trường M3 điều kiện ủ lắc ngang, 40 vòng/phút ở 38oC trong 2 ngày.
- Chủng dịch nấm men mật số 106 tế bào/ml với tỉ lệ thích hợp được xác